Dies ist ein einfaches und zeitsparendes Protokoll zur Isolierung und Konzentration kleiner extrazellulärer Vesikel aus mesenchymalen Stammzellen. Diese Technik ist in den meisten Laboren leicht anzuwenden, da es sich um einen Tischmaßstab handelt, für den nur einfache Instrumente erforderlich sind. Um kleine extrazelluläre Vesikel zu isolieren, empfehlen wir, Zellen in großem Maßstab zu züchten, um mindestens hundert Millionen Zellen zu erhalten.
Obwohl es einfach klingt, werden bestimmte kritische Schritte dieser Technik besser durch visuelle Demonstrationen informiert. Wir hoffen, dass die Forschenden aus unseren Erfahrungen lernen und die Fähigkeiten sicher beherrschen können. Unser Doktorand, Herr Chan, Hong Hao, wird Sie durch unsere Erfahrungen in der Isolierung und Charakterisierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus mesenchymalen Stammzellen führen.
Zentrifugieren Sie zunächst das konditionierte Medium bei 200 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellreste zu entfernen. Sammeln und filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um Partikel zu entfernen, die größer als 220 Nanometer sind. Befüllung einer Zentrifugalfilteranlage mit 30 Millilitern 0,2 Mikrometer filtrierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
Anschließend zentrifugieren Sie die Zentrifugalfiltereinheit bei 3.500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Geben Sie 70 Milliliter filtriertes konditioniertes Medium in die Zentrifugalfiltereinheit und zentrifugieren Sie das Gerät bei 3.500 g bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Fügen Sie 30 Milliliter filtrierte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu und zentrifugieren Sie das Gerät bei 3.500 g bei vier Grad Celsius. Setzen Sie einen Konzentratauffangbecher auf die Filtereinheit und zentrifugieren Sie bei 1.000 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius, um die gereinigten kleinen extrazellulären Vesikel zu erhalten.
Filtern Sie die kleinen extrazellulären Vesikel durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter. Übertragen Sie die Proben in neue Röhrchen und lagern Sie sie zur weiteren Analyse bei 80 Grad Celsius. Um mit der Nanopartikel-Tracking-Analyse zu beginnen, verdünnen Sie die isolierten mesenchymalen Stammzellen der humanen Nabelschnur, kleine extrazelluläre Vesikel in gefilterter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, auf 20 bis 100 Partikel pro Bild.
Geben Sie einen Milliliter der verdünnten Probe mit Einwegspritzen von einem Milliliter in die Anti-A-Kammer. Stellen Sie die Messeinstellungen entsprechend ein. Stellen Sie die Kamerastufe auf Stufe 14 ein.
Klicken Sie für jede Messung auf das Standardmaß und stellen Sie die Verdünnung entsprechend ein. Klicken Sie anschließend auf Aufnehmen, Kamera starten und stellen Sie die Kamerastufe auf 14 ein, um die kleinen Elektrofahrzeuge zu visualisieren. Um die Messung zu starten, klicken Sie auf Erstellen, dann auf Skript ausführen und wählen Sie den Speicherort aus, an dem die Dateien gespeichert werden sollen.
Geben Sie die erforderlichen Details des Beispiels ein und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die Einstellung OK, um das Skript fortzusetzen, und klicken Sie auf OK, um die Messung zu starten. Sobald die Messung aufgezeichnet wurde, analysieren Sie die Ergebnisse mit einer Erkennungsschwelle von fünf, um 10 bis 100 rote Kreuze pro Bild einzubeziehen. Und die Anzahl der blauen Kreuze ist auf fünf begrenzt.
Klicken Sie auf Einstellung OK, um das Skript fortzusetzen und die Analyse zu starten. Klicken Sie auf OK, wenn das Skript die Benachrichtigung über den Abschluss und den Export enthält, um die Daten an den festgelegten Speicherort zu exportieren. Die aus der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen, kleine extrazelluläre Vesikel, werden mit eiskaltem Radioimmunpräzipitations-Assay-Lysepuffer lysiert und 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.
Sammeln Sie den Überstand nach dem Zentrifugieren bei 200 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Quantifizieren Sie das Protein mit einem BCA-Assay. Stellen Sie das Gelelektrophorese-Set entsprechend zusammen und führen Sie die Gelelektrophorese bei 90 Volt durch, bis das Protein das Ende des Stapelgels erreicht.
Ändern Sie die Spannung auf 200 Volt, um die Proteine bis zum Ende des auflösenden Gels zu trennen. Führen Sie einen halbtrockenen Transfer durch, um die Proteine eine Stunde lang bei 15 Volt aus dem Gel auf eine Polyvinylidendifluoridmembran zu übertragen. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 3 % Kälberserumalbumin in trisgepufferter Kochsalzlösung 0,1 % Tween 20 für eine Stunde auf einem Schüttler bei Raumtemperatur.
Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit Primärantikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht unter ständigem Schütteln. Am nächsten Tag wird die PVDF-Membran fünfmal und jeweils fünf Minuten mit TBST gewaschen und mit einem Sekundärantikörper eine Stunde lang unter Rühren bei Raumtemperatur weiter inkubiert. Waschen Sie die PVDF-Membran erneut fünfmal mit TBST und visualisieren Sie die Membran in einem ladungsgekoppelten Imager mit einem Chemilumineszenz-Detektionsreagenz.
Analysieren Sie das Expressionsniveau der Proteine mit der ImageJ-Software. Öffnen Sie zunächst die Bilddatei in ImageJ. Verbessern Sie die Bildqualität, indem Sie Helligkeit und Kontrast anpassen.
Passen Sie das Bild an, bis die Flecken deutlich sichtbar sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format. Für die transmissionselektronenmikroskopische Analyse wird ein Teil der aus der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellenprobe mit vier Teilen filtrierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf ein Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern verdünnt und 15 Minuten lang auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter inkubiert.
Entfernen Sie die überschüssige Probe mit einem Labortuch und lassen Sie sie drei Minuten lang an der Luft trocknen. Inkubieren Sie 10 Mikroliter 1%ige Phosphowolframsäurelösung, um die Probe drei Minuten lang zu färben. Entfernen Sie die überschüssige 1%ige Phosphowolframsäurelösung mit einem Labortuch und lassen Sie sie drei Minuten lang an der Luft trocknen, um sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop abzubilden.
Die kleinen extrazellulären Vesikel der menschlichen Nabelschnur aus mesenchymalen Stammzellen haben eine Partikelgröße von 53 Nanometern, während andere signifikante Peaks der Partikelgröße 96 und 115 Nanometer betrugen. Die mit NTA gemessene Konzentration von kleinen extrazellulären MSC-Vesikeln aus menschlicher Nabelschnur betrug 7,75 mal 10 bis 10 Partikel pro Milliliter. Die mit dem BCA-Assay gemessene Proteinkonzentration der kleinen extrazellulären MSC-Vesikel aus menschlicher Nabelschnur betrug etwa 80 Mikrogramm pro Milliliter.
In der Western-Blotting-Analyse zeigten die kleinen extrazellulären MSC-Vesikel der menschlichen Nabelschnur positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101, waren aber negativ für GRP94. Die isolierten humanen MSC-kleinzellulären MSC-Vesikel wurden unter TEM visualisiert, um ihre Größe und Morphologie zu bestimmen. Humane mesenchymale Stammzellen aus der Nabelschnur waren kleine extrazelluläre Vesikel mit einer Größe von etwa 100 Nanometern und zeigten eine becherartige Doppelschicht-Membranstruktur.
Mit der erfolgreichen Entwicklung des Protokolls können wir nun das therapeutische Potenzial von mesenchymalen Stammzellen aus kleinen extrazellulären Vesikeln in der regenerativen Medizin aufdecken.
