Herkömmliche Diffusionskulturmethoden sind oft nicht in der Lage, die komplexe Umgebung lebender Organe zu rekapitulieren, was zum Verlust gewebespezifischer Marker und Funktionen führt. Wir haben einen offenen Chip entwickelt, der Diffusionskultur und mikrofluidisches Prinzip kombiniert, um die Mikroumgebung von Epithelgeweben genau nachzuahmen. Durch die Einbeziehung biochemischer und biomechanischer Signale, die natürlicherweise in lebenden Organen vorhanden sind, aber von herkömmlichen In-vitro-Modellen oft vernachlässigt werden, stellt der offene Chip eine bessere Alternative zwischen geschlossenen Systemen dar.
Das Verfahren wird heute von Adya Panchal, einer Forschungsstudentin in meinem Labor, demonstriert. Bringen Sie zunächst die erforderlichen Reagenzien unter die Biosicherheitswerkbank auf Eis. Kultur gewebespezifischer mesenchymaler Zellen, um eine Konfluenz von 80 % bis 90 % zu erreichen, und dissoziieren Sie die Zellen dann mit Trypsin oder anderen Methoden gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
Pelletieren Sie die Zellen bei 250 g für fünf Minuten bei 24 Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Zellpellet in jeweils 225 Mikrolitern eiskaltem 10X EMEM und Rekonstruktionspuffer. Mischen Sie die Zellen durch Pipettieren und fügen Sie 1.800 Mikroliter eiskalte Kollagen-1-Lösung hinzu.
Als nächstes mischen Sie die Pre-Gel-Lösung auf Eis, indem Sie fünf- bis sechsmal auf und ab pipettieren. Neutralisieren Sie die Pre-Gel-Lösung mit 18 Mikrolitern einer normalen Natriumhydroxid, mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren und pipettieren Sie dann 150 Mikroliter zellbeladenes Hydrogel in die zentrale Kammer des offenen Chips, wobei Blasen vermieden werden. Gruppieren Sie die Chips in separate Petrischale, einschließlich einer Zentrifugenröhrchenkappe, die mit zwei Millilitern sterilem, doppelt destilliertem Wasser in jeder Petrischale gefüllt ist, und inkubieren Sie die Petrischalen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Um eine Oberflächenmikrostrukturierung des Stroma-Hydrogels durchzuführen, pipettieren Sie 20 Mikroliter der neutralisierten Kollagen-1-Vorgellösung auf die strukturierte Oberfläche eines sterilen 3D-gedruckten Stempels und führen Sie den Stempel in die offene Kammer ein, während das Stroma-Hydrogel noch in flüssiger Form vorliegt. Entfernen Sie alle Hydrogel-Rückstände, die von der Oberseite der offenen Kammer verschüttet werden könnten, mit einem Absauger. Gruppieren Sie alle Chips in separate Petrischalen mit einer konischen Röhrchenkappe, die mit Wasser gefüllt ist, wie zuvor gezeigt.
Und inkubieren Sie alle Petrischalen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 90 Minuten. Bringen Sie die Chips am Ende der Inkubation wieder unter die Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie die Stempel vorsichtig mit einer Präzisionspinzette, um das Risiko einer Beschädigung des Hydrogels zu verringern. Sobald die kultivierten Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht haben, dissoziieren Sie die Zellen mit proteolytischen Enzymverfahren, wie vom Zellanbieter empfohlen.
Nach der Dissoziation werden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und die Epithelzellen auf die entsprechende Zellfragmentdichte, wie im Manuskript beschrieben, resuspendiert. Um die Epithelzelle zu besiedeln, übertragen Sie die Chips aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank und spülen Sie die Stromaoberfläche dreimal mit 100 Mikrolitern frischem Epithelzellkulturmedium, um überschüssige Beschichtungslösung zu entfernen. Sobald das Spülmedium angesaugt ist, besäen Sie die Hydrogeloberfläche mit 50 Mikrolitern der Epithelzellsuspension bei entsprechender Zelldichte und übertragen Sie die Chips dann für zwei Stunden zurück in den Inkubator.
Um Zellreste zu entfernen, spülen Sie die Hydrogeloberfläche zweimal vorsichtig mit dem Zellkulturmedium ab, frischen Sie das Medium durch Autoklavieren in versiegelten autoklavierbaren Behältern auf und schließen Sie die Chips an die Peristaltikpumpe an. Halten Sie die Peristaltikpumpe an, trennen Sie vorsichtig die Späne von der Pumpe und ziehen Sie den Spänegehäuseträger heraus. Nachdem Sie die Späne aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank überführt haben, entfernen Sie das verbleibende Volumen des Mediums in den oberen Behälter.
Saugen Sie dann das gesamte Medium vorsichtig aus dem oberen mikrofluidischen Kanal ab und klemmen Sie den kurzen mikrofluidischen Schlauch, der mit den oberen Einlässen verbunden ist, mit Bindemittelklammern fest, um die Medienverdunstung und die Aufrechterhaltung der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) zu reduzieren. Legen Sie den offenen Chip auf dem Gehäuseträger zurück in den Inkubator. Schließen Sie die Chips wieder an die Peristaltikpumpe an und setzen Sie den Durchfluss fort, indem Sie die Schlauchpumpe starten.
Spülen Sie die Gefäßkammer mit Endothelzellkulturmedium und säen Sie dann 25 Mikroliter Endothelzellsuspension aus. Drehen Sie die Chips auf den Kopf, damit sich die Endothelzellen an der Oberseite der mikrofluidischen Kammer festsetzen können. Die Chips in Petrischalen gruppieren.
Legen Sie sie wie zuvor gezeigt wieder in den Inkubator und lassen Sie die Endothelzellen eine Stunde lang anhaften. Übertragen Sie die Chips am Ende der Inkubation aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank und spülen Sie den Gefäßkanal zweimal mit Endothelzellkulturmedium, um Zelltrümmer zu entfernen. Legen Sie die Chips flach hin, um die Adhäsion der Endothelzellen an der Unterseite des Gefäßkanals zu erleichtern.
Füllen Sie den Behälter des Gefäßmediums mit dem entgasten Gefäßzellkulturmedium unter der Biosicherheitswerkbank. Legen Sie die Chips wieder in den Chipgehäuseträger und verbinden Sie die Chips wieder mit den Mediumbehältern an einem Ende und der Peristaltikpumpe am anderen Ende. Überprüfen Sie die mikrofluidischen Verbindungen, um sicherzustellen, dass alle Chips richtig angeschlossen sind und keine sichtbaren Tröpfchen des Mediums tropfen.
Setzen Sie dann den Flüssigkeitsfluss wieder ein, indem Sie die Peristaltikpumpe starten. Die mikrostrukturierte Geloberfläche mit und ohne Zellen wird visualisiert. Die histologische Analyse ergab reife, mehrschichtige geschichtete Epidermis, die auf dem Chip differenziert war.
Das Draufsichtbild des Hautchips zeigte das Vorhandensein der Fibroblasten in der Hautschicht. PECAM-1, VE-Cadherin und von Willebrand zeigten die Differenzierung von humanen mikrovaskulären Endothelzellen, die im offenen Hautchip kokultiviert wurden. MUC5AC, Alpha- und Beta-Tubulin, Chlorozellprotein 16, p63 und ZO-1-Fluoreszenzfärbung zeigten reifes Atemwegsepithel.
Die schlagenden Zilien und das differenzierte reife, pseudostratifizierte Epithel wurden auf einem oben offenen Atemwegschip beobachtet. Typ-I-, Typ-II- und E-Cadherin-Fluoreszenzfärbungen zeigten das Vorhandensein von reifen Pneumozyten auf dem Chip. Die Elektronenmikroskopie ergab das Vorhandensein von Mikrovilli und lysosomalen Vesikel, was auf einen reifen alveolären Phänotyp hinweist.
Die histologische Analyse zeigte das Vorhandensein von flachen Plattenepithelzellen, die mit dem Typ-I-Phänotyp übereinstimmen, und quaderförmigen, kopfsteinpflasterartigen Zellen, die mit dem Typ-II-Phänotyp kohärent sind, sowie Fibroblasten innerhalb der Hautschicht. Das Vorhandensein von Enterozyten und des reifen Kelches wurde durch Mucin-2- und E-Cadherin-Färbung bestätigt. Die Fibroblasten in der Hautschicht bestätigten das Vorhandensein eines einfachen säulenförmigen Epithels.
Alle Reagenzien müssen kalt sein und die Oberflächen des Gels sollten ausreichend gespült werden, um eine gleichmäßige Oberfläche zu erhalten. Es ist wichtig, alle nicht haftenden Zellen und Ablagerungen zu entfernen, um eine gleichmäßige Zelladhäsion und eine kompakte, verschmutzte Monoschicht und Gefäßwand zu erhalten. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um andere Arten von Epithelorganmodellen wie den Darm und die Lunge zu generieren, um zu beurteilen, wie bestimmte Medikamente oder Umweltfaktoren die Homöostase des menschlichen Gewebes beeinflussen können, mit besonderem Schwerpunkt auf der Funktion der Epithel- und Gefäßbarriere.
Durch den einfachen Zugang zur Wirksamkeitsphase des Stromakompartiments kann die Forschung nun spezifische Gesichtsmuster erzeugen und funktionelle Gewebearchitekturen, wie z. B. die Cryptviveoli, reproduzieren, was mit anderen Geräten nur schwer zu erreichen ist.
