Diese Methode wird verwendet, um die Beweglichkeit der Kultur zu bewerten, indem die Erntekontraktion gezählt und die Nahrungsverteilung nur im Verdauungsmittel erkannt wird. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie kontinuierlich die Beweglichkeit der Ernte bewertet. Es ist kostengünstig und einfach durchzuführen.
Diese Methode ermöglicht es, nur Füllstoff als Modell zu verwenden, um die Verdauungsfunktion auf den Nahrungsgängen im Magen-Darm-Trakt zu untersuchen. Helfen, den Prozess zu demonstrieren wird Junmeng Xi, ein Student aus meinem Labor. Halten Sie Fliegen in Fläschchen mit 10 Milliliterfrisch erlegten Lebensmitteln in einem 25 Grad Celsius Inkubator mit 60% Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen hellen, 12-stündigen dunklen Zyklus.
Stellen Sie sicher, dass eine große Anzahl der Wunsch-Phänotyp-Fliegen gleichzeitig eclose, indem Sie junge Fliegen mit Standardnahrung mit trockener Hefe kultivieren, dann die erwachsenen Fliegen auf eine Durchstechflasche mit nasser Hefe übertragen und zwei Tage für die Eiablage zulassen. Lassen Sie die Eier im Brutkasten, um erwachsene Fliegen zu entwickeln und in eine neue Durchstechflasche zu bringen, um mehr Eier zu sammeln. Sammeln Sie die geschlossenen männlichen oder weiblichen Fliegen jeden Tag und Kultur sie in neuen Fläschchen mit Standard-Lebensmittel auf das gewünschte Alter.
Anästhesisieren Sie die Fliegen mit Kohlendioxid und übertragen Sie eine Fliege in eine Sezierenplatte gut mit 200 Mikroliter PBS. Greifen Sie die Fliege an ihrem Thorax mit einer Pinzette und öffnen Sie den Thorax mit einem anderen Paar Pinzette dann ziehen Sie die Enden in entgegengesetzte Richtungen, um den Bauch zu öffnen. Nehmen Sie vorsichtig die Ernte und darm aus dem Körper und warten Sie, bis die Fliege aufwacht.
Wenn die Fliege wach ist, zählen Sie die Anzahl der Ernteverträge in einer Minute. Wiederholen Sie die Kontraktionszählung fünfmal und warten Sie 30 Sekunden zwischen den einzelnen Zählungen. Wiegen Sie den blauen Farbstoff und lösen Sie ihn in PBS in einer Konzentration von 20%.
Dann rühren Sie es in die gekochte flüssige Pflegenahrung auf eine Endkonzentration von 5% während des Lebensmittelkühlprozesses. Nachdem Sie Fliegen vier Stunden lang in Fläschchen mit Hungerfutter gehalten haben, überführen Sie sie in neue Fläschchen mit dem gefärbten Essen und bebauen Sie sie für die gewünschte Zeit, wobei Zudenken, dass das Essen bei Wartungsbedingungen in etwa zwei Stunden durch die Fliege geht. Übertragen Sie eine anästhesierte Fliege in einen Sezierenden Plattenbrunnen, der 200 Mikroliter PBS enthält.
Verwenden Sie Pinzette, um die Fliege am Thorax zu greifen und den Kopf mit einem anderen Paar Pinzette zu entfernen, dann übertragen Sie den Körper zu einem neuen Brunnen mit PBS und waschen Sie es mit sanftem Schütteln, um den Farbstoff am Körper befestigt zu entfernen. Öffnen Sie den Bauch mit zwei Pinzetten und trennen Sie vorsichtig den ganzen Darm vom Körper. Nehmen Sie die Ernte aus dem ganzen Darm und legen Sie es in ein Rohr mit 100 Mikroliter PBS.
Legen Sie den Rest des Darms in ein anderes Rohr mit 100 Mikroliter PBS dann verwenden Pipettenspitzen, um die Ernte und Darm zu schleifen und lösen Sie den Farbstoff in PBS. Wiederholen Sie die Sezierung, bis genügend Pflanzen und Eingeweide gesammelt werden. Nach dem Sammeln der Proben zentrieren Sie die Rohre mit der höchsten Geschwindigkeit für eine Minute und übertragen Sie 90 Mikroliter Überstand auf gut eine 96-Well-Platte.
Machen Sie eine Reihe von Standard-Blaufarbstoff verdünnungen in Konzentrationen von einmal 10 bis 7 bis 10 bis 4. Gramm pro Milliliter und fügen Sie sie zu den Brunnen. Messen Sie die Absorption bei 630 Nanometern der Brunnen und verwenden Sie die Standardmessungen, um einen Liniendiagramm der Absorptions- und Farbstoffkonzentration zu zeichnen. Verwenden Sie dann die Kurve, um die Farbstoffkonzentration der Proben zu berechnen.
Der Pflanzenmotilitätstest wurde verwendet, um Erntekontraktionen auf drei Tage alte NPRL-Mutantenfliegen und genetische Hintergrundkontrollen zu zählen. Es wurde festgestellt, dass die Mutation die Rate der Erntekontraktion signifikant verringerte. Um die Funktion von NPRL2 auf der Ernte weiter zu bestätigen, wurde die Nahrungsbewegung durch die Fütterung von gefärbten Lebensmitteln an die Fliegen nachgewiesen.
Alle Fliegen hatten ähnliche Mengen an Farbstoff in der Ernte, aber die NPRL2 Fliegen hatten weniger Farbstoff im Darm, die mit der verringerten Erntekontraktionsrate verbunden sein können. Achten Sie bei der Eingabe dieses Protokolls darauf, dass die Ernte mit dem Körper in Kontakt bleibt und die Fliege lebendig und wach ist. Andernfalls verliert die Ernte die Fähigkeit, sich zu verancverträge.
Während des Sezierens sollten die Ernte und der Darm in Kontakt sein. Wenn Farbstoffe in das Seziermedium austreten, kann die Probe nicht mehr verwendet werden. Lassen Sie uns einfach unseren Appetit füllen und der Lebensmittelauswurf innerhalb kurzer Zeit kann auch durch die Erkennung der Farbstoffmenge im ganzen Darm bewertet werden.
