Dieses Protokoll ermöglicht eine nicht-invasive Transplantation von iPSMG in das immunkompetente Mäusegehirn durch Kombination eines pharmakologischen Ein- und Ausschaltens eines CSF1-Rezeptorantagonisten PLX5622 mit einer transnasalen Transplantation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass iPSMG transplantiert werden kann, ohne Hirnschäden zu verursachen, selbst bei immunkompetenten Mäusen. Die Mikrogliatransplantation kann als mögliche Therapie dienen, um dysfunktionale Mikroglia in Zukunft bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen mit funktionellen auszutauschen.
Das Verfahren wird Bijay Parajuli, ein Forscher aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit dem schnellen Auftauen der gefrorenen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten menschlichen Mikrogliazellen in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad. Schwenken Sie die Proben, bis alles sichtbare Eis geschmolzen ist.
Geben Sie das aufgetaute iPSMG in die Kulturmedien, erwärmt auf 37 Grad Celsius. Fügen Sie einen Milliliter Zellen zu 10 Millilitern Kulturmedien hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g für fünf Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten.
Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie das Transplantationsmedium hinzu, um eine Zellkonzentration von 10 bis fünf Zellen pro Mikroliter zu erhalten. Legen Sie das iPSMG auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort.
Um Mäuse für die transnasale Transplantation vorzubereiten, füttern Sie die männlichen Mäuse sieben Tage lang mit einer Diät, die PLX enthält. Beenden Sie am Ende des siebten Tages die PLX-Diät und füttern Sie die Mäuse mit einer normalen Diät. Eine Stunde vor der transnasalen Transplantation von iPSMG 2,5 Mikroliter Hyaluronidase in PBS zweimal mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in PBS verabreichen, um die Durchlässigkeit der Nasenschleimhaut zu erhöhen.
Legen Sie die Mäuse nach der Hyaluronidase-Anwendung in Rückenlage. Verabreichen Sie 2,5 Mikroliter Hyaluronidase zehn Minuten vor der transnasalen Transplantation von iPSMG. Tragen Sie 2,5 Mikroliter Zellsuspension mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auf.
Legen Sie die Maus fünf Minuten lang in Rückenlage, bevor Sie die Zellsuspension in das andere Nasenloch verabreichen. Verabreichen Sie die Zellsuspension viermal und wenden Sie ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern pro Tier an. Wiederholen Sie 48 Stunden nach Beendigung der PLX-Fütterung die Verabreichung von Hyaluronidase und Zellsuspension an denselben Mäusen.
Zur Verabreichung von Zytokinen 2,5 Mikroliter des Transplantationsmediums mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auftragen. Nach zwei Monaten transnasales Transplantation kann die Anzahl der transplantierten Zellen bestimmt werden, indem Zellen gezählt werden, die sowohl für humanspezifische als auch für panmikrogliale Marker positiv sind. Endogene Mausmikroglia sind nur für pan-Mikroglia-Marker positiv.
Bei Kontrollmäusen wurden sowohl im Kortex als auch im Hippocampus nur Mausmikroglia nachgewiesen. Im Kortex von iPSMG-transplantierten Mäusen wurden nur Mausmikroglia nachgewiesen, während im Hippocampus iPSMG nachgewiesen wurden. Beim Versuch dieses Protokolls ist die vollständige Entfernung des Überstands unerlässlich, um die Verdünnung von Zytokinen zu verhindern.
Es ist wichtig, Zytokin alle 12 Stunden für die Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen anzuwenden. Die Erschöpfung der endogenen Mausmikroglia ist für die Transplantation von iPSMG erforderlich. Dieses Verfahren ermöglicht die Transplantation von iPSMG in ein normales oder krankes Mäusegehirn.
So können die charakteristischen Eigenschaften von iPSMG sowie das Ansprechen auf Krankheiten bestimmt werden. Diese Technik eignet sich, um die in vivo Charakteristik von iPSMG im Gehirn der Maus zu bestimmen. Daher wird die Transplantation von iPSMG in Krankheitsmodellmäuse uns helfen, die Reaktion zu verstehen und kann den Weg für ein neues therapeutisches Ziel ebnen.
