Dieses Verbrennungsverletzungsmodell ist in der Lage, die klinischen Situationen zu rekapitulieren, die bei hospitalisierten Verbrennungspatienten nach Verbrennungsverletzungen wie Immundysregulation und bakteriellen Infektionen beobachtet wurden. Diese Methode zur Induktion von Verbrennungen bei Ratten ist leicht zu erlernen und kann für die Entwicklung und Bewertung neuer Tropenmedikamente gegen Brandwunden und Infektionen verwendet werden. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Wundheilung sowie das Fortschreiten der bakteriellen Infektion an der Verbrennungsstelle zu bewerten.
Diese Verbrennungsinduktionsmethode kann auch in Maus- und anderen Tiermodellen zur Verbrennungsinduktion und zur Untersuchung der bakteriellen Infektion von Brandwunden verwendet werden. Bereiten Sie die betäubte Ratte auf die Brandverletzung vor, indem Sie sie in Bauchlage über ein Heizkissen bewegen. Tragen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze Augengleitmittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
Rasieren Sie den Rückenbereich der Ratte mit einer elektrischen Haarschneidemaschine in einem großen Rechteck von den Schulterblättern bis zum Schwanzansatz. Wischen Sie die losen Haare aus dem rasierten Bereich mit dem in Kochsalzlösung getränkten Gewebe aus. Tragen Sie die Haarentfernungslotion mit einem Applikator mit Wattespitze auf die rasierte Stelle auf.
Wischen Sie den Bereich nach drei Minuten zweimal mit einem feuchten Mullschwamm ab, um die Lotion zu entfernen und Hautreizungen zu vermeiden. Schalten Sie das Isofluran aus und entfernen Sie den Nasenkegel, bevor Sie die Ratte in den Auffangkäfig setzen. Stellen Sie am Tag des Verbrennungsverletzungsexperiments die Wasserbadtemperatur auf 97 Grad Celsius ein und legen Sie eine Stunde vor dem Experiment 420 Gramm von vier Kupferstäben in das Wasserbad.
Sobald die Ratte nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen an allen Gliedmaßen reagiert, legen Sie sie in Bauchlage auf das Heizkissen und injizieren Sie 20 Milligramm Morphin pro Kilogramm Körpergewicht über die intraperitoneale oder IP-Wurzel zur Schmerzbehandlung. Überprüfen Sie anschließend die Wasserbadtemperatur. Stellen Sie den Timer ein und ziehen Sie die hitzebeständigen Handschuhe an.
Nehmen Sie einen erhitzten Kupferstab aus dem Wasserbad und berühren Sie ihn sieben Sekunden lang auf dem Rückenbereich. Wenden Sie sofort die nächsten drei Verbrennungen nacheinander mit einem Stäbchen pro Verbrennungsstelle an und erzeugen Sie eine Vollkontaktverbrennung von ca. 20% der gesamten Körperoberfläche. Wiederbelebung des Tieres nach der Verbrennung, indem 0,1 Milliliter pro Gramm Körpergewicht laktierte Ringer-Lösung über den IP-Weg injiziert werden.
Wenn Sie fertig sind, schalten Sie das Isofluran aus. Entfernen Sie den Nasenkegel und legen Sie die Ratte auf die Heizmatte. Zentrifugieren Sie am Verbrennungs- und Infektionstag die Pseudomonas aeruginosa- oder Staphylococcus aureus-Kultur separat bei 4.000 mal g für 5 Minuten.
Waschen Sie das Pellet mit normaler Kochsalzlösung, bevor Sie das Pellet mit Kochsalzlösung auf eine optische Dichte von 0,1 bei 600 Nanometern verdünnen. Verdünnen Sie 200 Mikroliter der Bakteriensuspension mit 800 Mikrolitern Kochsalzlösung und erhalten Sie das gewünschte bakterielle Inokulum von 2 mal 10 bis zur 7. koloniebildenden Einheit oder KBE pro Milliliter. 15 Minuten nach der Verbrennung injizieren Sie subkutan 50 Mikroliter verdünntes Inokulum der Bakterien in der Nähe des Verbrennungsbereichs mit einer 29-Gauge-Nadel.
Legen Sie die Ratte zur Erholung auf das Heizkissen. Bringen Sie das geborgene Tier nach 15 bis 20 Minuten in einen sauberen Käfig. Bewerten Sie die Hautverletzung unmittelbar nach der Brandverletzung morphologisch in Bezug auf Farbe und Rand.
Analysieren Sie nach der Euthanasie das vollständige Blutbild, um die Wirkung der Verbrennungsinduktion auf das Immunsystem des Wirts zu bestimmen. Sammeln Sie das Gewebe der euthanasierten Ratte in einem 10-Milliliter-Sammelröhrchen. Homogenisieren Sie die Proben mit einem Gewebehomogenisator und verdünnen Sie die Gewebehomogenate seriell in normaler Kochsalzlösung.
Platte 100 Mikroliter unverdünntes Homogenat und alle Verdünnungen jeder Gewebeprobe, die von P.Aeruginosa-infizierten Ratten auf Cetrimid-Agarplatten gesammelt wurden. Nachdem Sie die Platten 16 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator inkubiert haben, zählen Sie die Bakterienkolonien auf den Platten. Multiplizieren Sie sie mit dem Verdünnungsverhältnis, um die KBE-pro-Milliliter-Zahl zu erhalten, und normalisieren Sie sie mit dem Gewicht des Gewebes, um das KBE-Programmgewebe zu berechnen.
Dieses hochgradig reproduzierbare Protokoll führte bei Ratten zu einer Brandverletzung dritten Grades in voller Dicke. Die Farbe der Brandverletzung änderte sich innerhalb von 24 Stunden bis 72 Stunden nach der Verbrennung von weiß nach braun. In der histologischen Analyse zeigten die Hautproben von verbrannten Tieren 24, 48 und 72 Stunden nach der Verbrennung Verletzungen in allen Schichten, während die nicht verbrannte Haut eine klare Unterscheidung von Epidermis, Dermis und subkutanen Gewebeschichten zeigte.
In verbrannten Hautproben wurden eine Zerstörung der Epidermisschicht und eine Schädigung der gesamten Dicke der Dermis mit subkutanem Fett und Skelettmuskulatur beobachtet. In 24 Stunden nach der Verbrennung war eine Verbrennung in voller Dicke mehr als 2,61 Millimeter tief. Bei der Bewertung der bakteriellen Clearance wurde bei allen Ratten mit Verbrennungsverletzungen eine bakterielle Erholung beobachtet.
Während der PAO1-Infektion mit P. aeruginosa war die Anzahl der Bakterien, die 24 Stunden nach der Infektion aus der Haut der verbrannten Ratte gewonnen wurden, geringer als das anfängliche Inokulum von 1 x 10 bis zur 6. KBE. Es nahm jedoch 48 und 72 Stunden nach der Infektion zu. Bei der Infektion mit S. aureus, ATC25923, wurde zu allen Zeitpunkten in der Haut im Vergleich zum ursprünglichen Inokulum ein Anstieg von 2 log 10 beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Etablierung einer S. aureus-Infektion auf die aktive Replikation im Gewebe zurückzuführen ist.
Das Unterhautgewebe und die Muskeln wiesen eine höhere Bakterienbelastung auf als Lunge und Milz. Die Daten zeigten, dass verbrannte Ratten 24 Stunden nach der Inokulation mit P. aeruginosa und 48 Stunden nach der Inokulation mit S. aureus eine systemische Infektion entwickelten. Entfernen Sie die Haare auf dem Rattenrücken vollständig und halten Sie die Temperatur und die Induktionszeit wie im Protokoll angegeben.
Die übrig gebliebenen Haare und die unterschiedliche Temperatur der Kupferstäbe können die Qualität der Verbrennung beeinträchtigen. Das Rattenbrandmodell kann erforscht werden, um neuartige topische Therapeutika zur Behandlung von Brandwundinfektionen und zur Bewertung verschiedener Wundauflagen zu evaluieren.
