Diese Methode ermöglicht es, intrazelluläre ähnliche Aktionspotentiale auf traditionellen MEA'S zu erfassen, wodurch eine bessere Beschreibung der AP-Form und eine empfindlichere Klassifizierung von proarrhythmischen Potentialen ermöglicht wird. Im Vergleich zu typischen Feldpotentialaufzeichnungen liefert die intrazelluläre ähnliche tatsächliche Potentialform mehr Einblick in die genaue Autorisierung der zugrunde liegenden Ionenkanäle. Bei Anwendung auf Kardiomyozyten, die von klinischen Patienten durch Stammzelltechnologie gewonnen werden, kann die Methode zur kausalen Diagnose und Personalisierung von C R P und Herzerkrankungen wie Arrhythmien beitragen. Unsere Technikerin Karin Gebhardt wird die Kardiomyozytenkultivierung demonstrieren.
Um die Elektrodenfelder der zuvor autoklavierten MEA's zu beschichten, Dropwise mit Fibronektin unter Verwendung einer 10 Mikroliter Pipette unter der Laminar-Flow-Haube. Um den osmotischen Schock zu reduzieren, geben Sie die Beschichtungslösung für 90 Sekunden tropfenweise in das 50-Milliliter-Röhrchen mit aufgetauten Kardiomyozyten. Geben Sie vorsichtig acht Milliliter Plattiermedium in das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig.
Entfernen Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu entsorgen, und stellen Sie die Zellzahl auf die Endkonzentration ein. Vor dem Zellensitzen die aufgetragene Beschichtungslösung mit einer 10-Mikroliter-Pipette aus dem MEA-Elektrodenbereich entfernen. Um ein Austrocknen der Beschichtung zu vermeiden, säen die Zellen sofort durch Zugabe von vier Mikrolitern der Zellen tropfenweise auf die Elektrodenfelder für sechs Vertiefung MEA und eine Vertiefung M E A.Lassen Sie nun die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid an den Vertiefungen haften.
Fügen Sie unter der Laminar-Flow-Haube 200 Mikroliter und einen Milliliter steriles Beschichtungsmedium hinzu, das auf 37 Grad Celsius erhitzt wird, für sechs Well MEA bzw. Single Well MEA. Platzieren Sie für MEA-Aufnahmen das MEA-System auf dem Gerät, wobei der MEA-Chiphalter zentriert über dem Objektivloch liegt. Lassen Sie dann den Laser auf die Elektroden fokussieren, indem Sie den MEA-Aufbau so positionieren, dass sich das Objektiv direkt unter dem Loch des MEA-Systems befindet.
Damit sich die Zellen von der mechanischen Störung erholen können, übertragen Sie den MEA-Chip mit den kultivierten Zellen 15 Minuten vor der Aufnahme aus dem Inkubator in das MEA-Setup. Als nächstes reinigen Sie die Kontaktpads und Stifte sorgfältig mit einem Isopropanol-Tupfer, um den Geräuschpegel zu verringern. Setzen Sie den MEA vorsichtig in den MEA-Aufbau ein und positionieren Sie den MEA-Chip mit sechs Vertiefungen und der Seriennummer auf der rechten Seite oder einen einzelnen MEA-Chip mit der Referenzelektrode auf der linken Seite.
Stellen Sie nun die integrierte Heizung des MEA-Systems auf 38 Grad Celsius ein. Schließen Sie den Deckel des Gerätes, da der integrierte Sicherheitsschalter die Aktivierung des Lasers nur ermöglicht, wenn der Deckel über dem MEA-Chip geschlossen ist. Mit dem MEA-Konfigurationsprogramm stellen Sie den Hochpass- und Tiefpass-MEA-Systemfilter auf 0,1 Hertz oder weniger bzw. 3.500 Hertz ein.
Verwenden Sie die MC-Rack-Software oder eine andere Software für die Aufnahme. Passen Sie den Eingangsbereich entsprechend dem Experiment an. Sicherstellen, dass das Signal den Verstärker und die Abtastrate nicht sättigt.
Nutzen Sie die Langzeitanzeigefunktion der Software, um die Aufnahme zu überprüfen. Nachdem Sie den MEA-Chip in das MEA-Setup eingesetzt und die Software eingerichtet haben, initialisieren Sie die Lasermechanik mit der FB ALP-Software. Klicken Sie nun auf die Schaltfläche Initialisierung.
Am Ende der Initialisierung befindet sich der virtuelle Laserpunkt in Bohrloch D für eine MEA mit sechs Vertiefungen und unten links für eine einzelne Vertiefung MEA. Bewegen Sie dann mit der Steuertaste per Mausklick den virtuellen Laserpunkt in die Mitte der Elektrode D five und stellen Sie den Fokus ein, indem Sie die Steuertaste gedrückt halten und mit dem Mausrad scrollen. Alternativ können Sie die Autofokus-Funktion verwenden.
Drücken Sie die Taste Set P one, und der virtuelle Laserpunkt bewegt sich automatisch in den Brunnen F. Das System ist jetzt ausgerichtet. Passen Sie die Laserleistung und die Prozesszeit entsprechend den experimentellen Anforderungen an. Um den Laser zu aktivieren, klicken Sie auf die Laser-Aus-Taste, die als Laser an angezeigt wird, Wechseln Sie zur Aufnahmesoftware.
Wählen Sie einen Dateinamen und klicken Sie auf die rote Aufnahmeschaltfläche, gefolgt von der Wiedergabeschaltfläche oben im Fenster, um die Messung aufzuzeichnen. Bevor Sie die Zellen mit dem Laser öffnen, nehmen Sie 60 Sekunden lang eine Baseline auf. Wechseln Sie zurück zur Initialisierungssoftware und deaktivieren Sie die vom Laser auszuschließenden Elektroden auf der virtuellen Karte auf der rechten Seite des Softwarefensters.
Um den Laser zu starten, klicken Sie mit der Alt-Maus und wählen Sie die mittlere Elektrode dieser Vertiefung aus. Dies initiiert den Laser, um die Zellen auf jeder Elektrode dieser Vertiefung automatisch zu öffnen, wiederholen Sie für jede Vertiefung, um alle zuvor aktivierten Elektroden dieser ausgewählten Vertiefung zu öffnen. Millimolarkonzentration von Nifedipin E-40 31 und Dofetilid werden zuerst in DMSO und dann in vollständigem Medium auf das 10-fache der gewünschten Konzentration gelöst.
Überschreiten Sie niemals eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,1% im Bohrloch. Zeichnen Sie die Baseline-Aktivität 60 Sekunden lang auf. Starten Sie die laserinduzierte Peration, wie zuvor gezeigt, was zu einer Umwandlung des FPS in liAPs führt.
Wenden Sie alle Medikamente als Einzelkonzentration pro Welle an. Entfernen Sie 20 Mikroliter und 100 Mikroliter Medium pro Bohrloch aus sechs MEAs bzw. Einzelbohrungen. Fügen Sie 20 Mikroliter oder 100 Mikroliter der zu messenden Arzneimittelstammlösung in die Vertiefung hinzu.
Je nach MEA-Typ zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren. Lassen Sie die Compounds 300 Sekunden einwaschen. Während dieser Zeit kann sich die liAP-Form in die FP-Form umwandeln.
Auch hier induzierte laserinduzierte Peration und Aufzeichnung möglicher verbindungsinduzierter Defekte auf dem liAP für weitere 60 Sekunden. Die Zugabe von Nifedipin reduzierte die Plateauphase der liAPs konzentrationsabhängig und verkürzte dadurch die gesamte liAP. Diese Verkürzung war vergleichbar mit den Feldpotentialen von Kardiomyozyten aus unmanipulierten Elektroden.
E-40 31 hemmte die Repolarisation relevanter KV ein Punkt 11 Kaliumkanäle und führte zum arrhythmischen Verhalten von Kardiomyozyten bei erhöhten Konzentrationen. Außerdem erhöhte E-40 31 die liAP-Dauer konzentrationsabhängig. Am Ende des liAP wurden kleine positive Spannungsauslenkungen bei 0,1 Mikromolar beobachtet, die mit höheren Konzentrationen stärker hervortraten, was auf eine vorübergehende neue Depolarisation hindeutet, die als EADs bezeichnet wird.
Bei der höchsten Konzentration von 0,1 Mikromolaren eskalierten diese EADs im Laufe der Zeit zu ektopischen Beats. Das sind verfrühte Aktionspotenziale. EAD und ektopische Beats sind Schlüsselindikatoren für proarrhythmische Aktivität.
Und am Ende führt die elektrische Aktivität zu arrhythmischen Schlägen. Die Konzentrationsreaktionsbeziehungen korrelierten mit FP- und liAP-Aufzeichnungen. Darüber hinaus zeigten sowohl FP als auch liAP in Gegenwart von Dofetilid Dauern von etwa zwei Sekunden innerhalb desselben Bohrlochs, die FP-Wellenform zeigte regelmäßige Repolarisationsablenkungen.
Während in der liAP EADs sind nachweisbar. Es ist wichtig, den Fokus vor jedem Melomen anzupassen, da ein unscharfes Mikroskopbild die Öffnung der Zellen beeinflussen könnte. Auch das Aktionspotenzial wird kurz nach der Opterperation für die Analyse verwendet.
Diese Technik ist empfindlicher bei der Erkennung früherer arrhythmischer Effekte im Vergleich zu Standard-MEA, was eine genauere Erkennung von Nebenwirkungen ermöglicht.
