Die Verwendung des Protokolls als biophysikalische Wirkung verschiedener optogenetischer Aktuatoren auf die Kardiomyozytenaktivität kann getestet werden, um bei der Entwicklung optogenetischer Experimente im Herzgewebe und im ganzen Herzen zu helfen. Durch die Kombination der Patch-Klemmtechnik mit Sarcomere-Tracking und Carbonfaser-unterstützten Kraftmessungen können wir die Auswirkungen der GtACR1-Photoaktivierung auf die Elektrik und Mechanik ventrikulärer Kardiomyozyten untersuchen. Optogenetische Hemmung kann potenziell für optische Defibrillation verwendet werden.
GtACR1 ist ein optogenetisches Werkzeug, das das Schweigen der Herzaktivität ermöglicht. Diese Technik ist voll anwendbar auf andere Forschungsbereiche wie glatte und einzellige Muskelzellstudien. Obwohl dieses Protokoll nicht für das Screening mit hohem Durchsatz verwendet werden kann, bietet es ein Mittel für die umfassende Analyse der elektrischen und mechanischen Funktion von Kardiomyozyten.
Wie das Sprichwort sagt, sagt ein Bild mehr als tausend Worte. Wie viele weitere Informationen können wir im Video vermitteln? Einige unserer Werkzeuge und Techniken, die an der Single Myozytendehnung und in der Sondenvorbereitung beteiligt sind, sind sehr kompliziert und es ist viel einfacher, sie in einem Video zu vermitteln, verglichen mit einer Beschreibung.
Nachdem das Blut von einem neun bis zehn Wochen alten neuseeländischen weißen Kaninchen aus dem säumigen durchnässten Herzen gewaschen wurde, schalten Sie das Perfusate auf eine kalziumarme, kaliumreiche Lösung um und durchdringen Sie das Herz noch zwei Minuten, nachdem das Herz aufhört zu schlagen. Durchdringen Sie die Enzymlösung, beginnen Sie, die Enzymlösung nach zwei Minuten Verdauung wieder in das Reservoir zurückzuzirkulieren, und verringern Sie die Geschwindigkeit nach fünf Minuten Verdauung auf 16 Milliliter pro Minute. Sobald das Gewebe nach 40-50 Minuten Verdauung weich erscheint, schneiden Sie das Herz von der Kanüle ab und legen Sie das Herz sofort in eine blockierende Lösung.
Fügen Sie eine Blockierlösung hinzu, bis das Gewebe vollständig abgedeckt ist. Schneiden Sie den rechten Ventrikel und das Septum ab und trennen Sie den linken Ventrikel. Entfernen Sie die Papillarmuskulatur und verwenden Sie feine Zangen und eine Pipette, um das Gewebe sanft auseinanderzuziehen, um die Zellen durch mechanische Dissoziation freizusetzen.
Filtern Sie die Zellsuspension durch ein Netz mit einem Millimeter quadratischen Poren und sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Dann setzen Sie das Kardiomyozytenpellet in frischer Blocklösung wieder aus. Für ein Patch-Klemmen-Experiment, Mantel autoklavierte Abdeckungen in einer Petrischale mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Laminin unmittelbar vor der Zellkultur.
Für Kohlefaserexperimente beschichten Sie Petrischalen mit 0,12 Gramm pro Milliliter Poly-HEMA in einer 95-zu-fünf-Ethanol-Wasser-Lösung. Zehn bis 15 Minuten nach der Wiederaussetzung der Kardiomyozyten, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in Kulturmedium. Nach dem Zählen säen Sie die Zellen auf einen Deckzettel in einer Petrischale mit einer Zieldichte von 1,75 mal 10 zu den vier Zellen pro Milliliter.
Inkubieren Sie die Kulturen für drei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Medium aus den Decklfesten durch ein frisches Medium, das Adenovirus Typ 5 für GtACR1-eGFP bei einer Infektionsvielzahl von 75 enthält. Bringen Sie die Kulturen für 48 Stunden in den Inkubator zurück.
Um ein Patch-Klemmen-Experiment durchzuführen, verwenden Sie einen Micropipette-Puller, um 1,7 bis 2,5 Megaohm Patchpipetten aus Soda-Kalkglas-Kapillaren zu ziehen und die Datenerfassungssoftware zu initialisieren. Legen Sie einen Deckelschlupf mit Zellen in die Messkammer mit externer Lösung und wählen Sie die Kardiomyozyten basierend auf ihrer eGFP-Fluoreszenz aus. Als nächstes füllen Sie eine Patch-Pipette mit interner Lösung und befestigen Sie die Pipette an der Pipettenhalterung, indem Sie den silberchloridbeschichteten Silberaufnahmedraht in die interne Lösung einsetzen.
Legen Sie den Membrantest so fest, dass 10 Millivolt-Impulse für 15 Millisekunden mit einer Basislinie von null Millivolt angewendet werden. Wechseln Sie nach Erreichen der zellengebundenen Konfiguration in den gesamten Zellmodus mit einem Haltepotenzial von minus 60 Millivolt in der Datenerfassungssoftware. Dann tragen Sie vorsichtig Unterdruck auf, um auf die gesamte Zellkonfiguration zuzugreifen, indem Sie die Membran brechen.
Ein erfolgreicher Bruch wird durch eine sofortige Erhöhung der gemessenen Kapazität nachgewiesen. Zeichnen Sie Photoaktivierungsprotokolle im Spannungsklemmenmodus bei minus 74 Millivolt mit Lichtimpulsen von 300 Millisekunden oder Aktionspotentiale im aktuellen Klemmmodus bei null Picoampere auf. Um die Kohlefasern herzustellen, montieren Sie zuerst die Pipette auf die Pipettenhalter des Abziehers.
Ziehen Sie die Glaskapillaren in zwei Pipetten mit einer Gesamtverjüngungslänge von ca. 11 Millimetern und einem endgültigen Innendurchmesser von ca. 30 Mikrometern. Als nächstes verwenden Sie ein Stereomikroskop, um eine Kapillare im Orientierungskreis auszurichten und um bis zu 45 Grad zu biegen, indem Sie mit einem Bieger auf die Spitze der Kapillare drücken. Erhitzen Sie das Filament, bis die Kapillare den 45-Grad-Winkel auch nach dem Entfernen des Biegees beibehält.
Nach dem Biegen der Kapillare verwenden Sie feine Zangen, die mit weichen Schläuchen ausgestattet sind, um eine Kohlefaser aus dem Rohr zu nehmen und in die feine Spitze der Kapillare einzupassen. Schieben Sie die Faser in der Kapillare bis zur Biegung. Schneiden Sie die Kohlefasern so, dass sie zwei Milliliter von der Spitze der Kapillare projizieren und verwenden Sie Cyanoacrylatkleber, um die Fasern an der Vorderseite jeder Kapillare zu fixieren.
Um die Fasern zu kalibrieren, befestigen Sie eine Kapillare an einem Halter, der von einem Mikromanipulator und einem Piezomotor gesteuert wird. Bewegen Sie die Kapillare in Richtung des Sensors und richten Sie sie relativ zum Sensor aus. Setzen Sie die Faserspitze in Kontakt mit dem Kraftsensor, ohne Kraft zu erzeugen.
Die Gesamtbewegung des Piezomotors beträgt 60 Mikrometer. Bewegen Sie den Piezomotor in sechs 10 Mikrometer Schritten in Richtung des Kraftsensors. Der Sensor hat eine Empfindlichkeit von 0,05 Millinewton pro Volt und einen Kraftbereich von 0 bis 0,5 Millinewton.
Auslesen Der gemessenen Spannung für jeden Schritt und entfernen Sie die Kohlefaser aus dem Sensor. Um die Kraft der Kontraktion von Kardiomyozyten aufzuzeichnen, beschichten Sie die Oberfläche eines Deckglases mit Poly-HEMA und legen Sie es in die Messkammer. Füllen Sie die Kammer mit externer Badlösung.
Befestigen Sie beide mit Kohlefaser beladenen Kapillaren am Bühnenmikromanipulator und richten Sie sie in einem Winkel aus, so dass die Kohlenstofffasern nahe an der Oberfläche der Messkammer liegen. Um zu überprüfen, ob die Fasern richtig ausgerichtet sind, konzentrieren Sie sich auf die Oberfläche der Messkammer, senken Sie die erste Faser und bewegen Sie die Faser horizontal. Die Spitze der Faser sollte auf der Oberfläche der Messkammer gleiten.
Befolgen Sie das gleiche Verfahren für die zweite Faser. Wenn die Lichter ausgeschaltet sind, fügen Sie der Kammer ein paar Tropfen kultivierte Zellsuspension hinzu und tragen Sie kurze grüne Lichtimpulse auf, um Zellen auszuwählen, die sich als Reaktion auf die Grüne Lichtstimulation zusammenziehen. Um die erste Faser zu befestigen, komprimieren Sie die Zelle vorsichtig, indem Sie die Faser senken und dann den Druck loslassen.
Befestigen Sie die zweite Faser parallel zur ersten am anderen Ende der Kardiomyozyten, um eine maximale Anzahl von Sarkomen zwischen den beiden Fasern zu haben. Nachdem beide Fasern befestigt sind, heben Sie die Fasern an, damit die Zelle nicht mehr in Kontakt mit der Kammeroberfläche ist. Bringen Sie die Sarkomes in den Fokus, stellen Sie das Sarcomere-Längenverfolgungsfenster zwischen den Fasern ein und verwenden Sie das Kantenerkennungsmodul, um die Faserbiegung zu verfolgen.
Stellen Sie die Erfassungsbereiche mit den roten und grünen Fenstern ein und definieren Sie einen Schwellenwert an der ersten Ableitung der Lichtintensitätsspur. Optisch beschleunigen Sie die Zelle, während Sie Sarcomere-Länge und Faserbiegen verfolgen. In diesem Fall haben wir 0,25 Hertz betragen.
Nach der Aufzeichnung von mindestens 15 optisch ausgelösten Kontraktionen, Feld stimulieren die Zelle elektrisch. Finden Sie den Schwellenwert für das Auslösen der Kontraktionen und wenden Sie das 1,5-fache der Schwellenspannung für elektrisches Tempo an. Für ein Hemmprotokoll, wenden Sie elektrische Reize an, um Kontraktionen auszulösen, und setzen Sie die Zelle dann einem anhaltenden Lichtimpuls bei verschiedenen Lichtintensitäten aus.
Rekorde mindestens 15 Kontraktionen nach lichtinduzierter Hemmung auf. GtACR1 wird in kultivierten Kaninchen-Kardiomyozyten ausgedrückt. Die GtACR1-Photoaktivierung bei einer Lichtintensität von vier Milliwatt pro Millimeter quadratisch für 300 Millisekunden ergibt große nach innen gerichtete Ströme bei minus 74 Millivolt bei einem gemessenen Spitzenstrom von 245 Picoampere.
In diesem repräsentativen Experiment wurden Aktionspotentiale entweder elektrisch mit Stromeinspritzungen ausgelöst, die 1,5-fache der Schwelle oder optisch mit 10 Millisekunden Lichtimpulsen. Optisch temporierte Kardiomyozyten zeigten ein langsameres Wirkungspotenzial. Elektrisch ausgelöste Wirkungspotentiale wurden unter anhaltendem Licht gehemmt.
Höhere Strominjektionen und das 1,5-fache der Schwelle während der anhaltenden Lichtanwendung entlocken ebenfalls keine Wirkungspotenziale. Die Kardiomyozyten erzeugten eine Kontraktionskraft von 232 Mikronewtons pro Millimeter, die bei elektrischem Tempo quadratisch ist, und 261 Mikronewton pro Millimeter, die nach dem optischen Tempo quadriert wurden. Längere grüne Lichtimpulse hemmten die Kontraktionen mit den nach der Hemmung wiederkehrenden Kontraktionen, die eine geringere kontraktile Kraft erzeugten, die dem diastolischen Kalziumverlust von Kaninchenkardiomyozyten entsprach.
Wir empfehlen, die Techniken vor der Durchführung eines Experiments zu üben, zumal die Positionierung der Mikrosonden im Dunkeln eine Herausforderung sein kann. ist sehr wichtig bei der Analyse der Kardiomyozytenkontraktilität, da es die Kraftproduktion und Entspannung beeinflussen kann. Verschiedene Nachladungen können auch für die isotonische und auxotonische Kontraktionsanalyse angewendet werden.
Diese Techniken ermöglichen die Charakterisierung der biophysikalischen Wirkungen der Aktivierung neu entwickelter optogenetischer Aktuatoren in Kardiomyozyten, was für die Auswahl des für jedes Experiment am besten geeigneten optogenetischen Werkzeugs entscheidend ist. Bitte beachten Sie, dass die Adenovirus-Transduktion und alle Schritte nach der Transduktion unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe II durchgeführt werden sollten.
