Die kardiale Sicherheitsbewertung ist eine entscheidende Komponente während des Arzneimittelentwicklungsprozesses. Humane iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten haben sich als zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung erwiesen. Wir haben Methoden etabliert, um die funktionellen Eigenschaften von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten umfassend zu untersuchen, die von wirklich wichtiger Krankheitsmodellierung, medikamenteninduziertem Cardio-Toxizitäts-Screening und Präzisionsmedizin sind.
Die zunehmende Einbeziehung humaner iPSC-abgeleiteter Kardiomyozyten in den standardmäßigen präklinischen Sicherheitsbewertungsprozess hat das Potenzial, die Genauigkeit der Toxizitätsvorhersage der Verbindungen eines Kandidaten zu verbessern. Beginnen Sie mit der Kultivierung der humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für mindestens 10 Tage, bevor Sie die Messung durchführen. Schalten Sie den Temperaturregler ein und stellen Sie ihn auf 37 Grad Celsius ein.
Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera und die Kohlendioxidversorgung ein. Füllen Sie den Wassermantel des Plattenhalters mit einer angemessenen Menge sterilen entionisierten Wassers. Legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter und inkubieren Sie die Zellen mindestens fünf Minuten lang.
Öffnen Sie die Ansichtssoftware und stellen Sie die Bildrate der Kamera auf 75 Bilder pro Sekunde und die Video- oder Bildauflösung auf 1024 x 1024 Pixel ein. Wenden Sie die Autofokus- und Autohelligkeitsfunktionen an, nehmen Sie Videos und Bilder von menschlichen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten auf. Platzieren Sie vorsichtig einen acht Mikroliter Tröpfchen extra zellulärer Matrixbeschichtungslösung über die Aufnahmeelektrodenfläche jeder Vertiefung der 48 Mikroelektroden-Array-Platten.
Fügen Sie dann drei Milliliter steriles entionisiertes Wasser in den Bereich um die Brunnen hinzu, um die Verdunstung der Beschichtungslösung zu verhindern. Entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze den größten Teil des extrazellulären Matrixmediums von der Vertiefungsoberfläche innerhalb derselben einzelnen Reihe oder Säule, ohne die Elektroden zu berühren. Aussaat von 50.000 Zellen pro Vertiefung in einem acht Mikroliter Tröpfchen Seeding Medium über die Aufzeichnungselektrodenfläche.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Vertiefungen mit Zellen plattiert sind. Dann inkubieren Sie die Mikroelektroden-Array-Platten in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator. Fügen Sie langsam 150 Mikroliter Seeding Medium in jede Vertiefung der Mikroelektroden-Array-Platten hinzu.
Überprüfen Sie am Tag 10 nach der Beschichtung die Dichte der spontan schlagenden menschlichen iPSC CM-Monoschicht unter einem Mikroskop. Setzen Sie die 48-Well-Mikroelektroden-Array-Platte in das Aufnahmegerät ein. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur 37 Grad Celsius und Kohlendioxid 5% beträgtÖffnen Sie die Navigator-Software.
Wählen Sie im Fenster für den Versuchsaufbau die kardiale Echtzeitkonfiguration und Feldpotentialaufzeichnungen aus. Wenden Sie spontane oder pastöse schlagende Konfigurationen an. Legen Sie unter Beat-Erkennungsparameter die Erkennungsschwelle auf 300 Mikrovolt, die minimale Schlagdauer auf 250 Millisekunden und die maximale Schlagdauer auf fünf Sekunden fest.
Wählen Sie die Polynomregression für die Berechnung der Feldpotentialdauer aus. Überprüfen Sie, ob das Ausgangssignal der elektrischen Aktivität ausgereift und stabil ist, und erfassen Sie die grundlegenden Herzaktivitäten für ein bis drei Minuten. Führen Sie die Aufnahme 10 Tage nach der Beschichtung durch.
Ersetzen Sie das humane iPSC CM-Erhaltungsmedium durch Tyrodenlösung und lassen Sie die Zellen 15 Minuten akklimatisieren. Stecken Sie die Temperatursensoren in die Kammer und legen Sie die 35-Millimeter-Schüssel hinein. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein.
Ziehen Sie die Mikropipetten mit einem Mikropipettenzieher aus Borosilikatglaskapillaren. Füllen Sie die Mikropipetten mit der intrazellulären Lösung und führen Sie sie in den Halter ein, der mit der Kopfstufe des Patchklemmverstärkers verbunden ist. Öffnen Sie die Erfassungssoftware, laden Sie das Aktionspotentialaufzeichnungsprotokoll und wählen Sie die Konfiguration der Spannungsklemme aus.
Führen Sie die Mikropipette in die Badlösung ein und wählen Sie geeignete einzelne menschliche iPSC-CMs aus. Stellen Sie die Position der Mikropipette neben der ausgewählten Zelle mit einem Mikromanipulator ein und senken Sie sie. Wenn die Pipettenspitze in die Badelösung eingeführt wird, überprüfen Sie den Pipettenwiderstand am Oszilloskopmonitor.
Positionieren Sie die Pipette in der Nähe der Zelle, und die Stromimpulse nehmen leicht ab, um den zunehmenden Dichtungswiderstand widerzuspiegeln. Wenden Sie eine sanfte Absaugung mit Unterdruck an, um den Widerstand zu erhöhen. Dies wird ein Gigasiegel bilden.
Wenden Sie dann die Siegelfunktion an. Wenden Sie zusätzliche Absaugung an, um die Membran zu brechen, um eine vollständige Zellaufzeichnungskonfiguration zu erhalten. Wechseln Sie an dieser Stelle über den Verstärkerdialog vom Spannungszangenmodus in den Stromzangenmodus oder keine Stromeinspeisung.
Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Aktionspotential-Aufzeichnungsdateien zu generieren und zu speichern. Führen Sie die vorübergehende Kalziummessung mindestens 10 Tage nach der Beschichtung durch. Bereiten Sie frische Tyrode-Lösung und Fura-2 AM-Ladelösung vor.
Saugen Sie das menschliche iPSC CM-Wartungsmedium ab und waschen Sie die Kammern zweimal mit Tyrode-Lösung. Tragen Sie 100 Mikroliter Fura-2 AM Ladelösung auf und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie die Fura-2 AM-Ladelösung durch Tyrode-Lösung und inkubieren Sie mindestens fünf Minuten lang, um Fura-2 AM vollständig zu entsternen. Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das 40-fache Ölimmersionsobjektiv eines inversen Epifluoreszenzmikroskops hinzu.
Setzen Sie die Zellkammer in den Tischadapter des Mikroskops ein. Installieren Sie die Kabel des Temperaturreglers an der Badekammer und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Installieren Sie die elektrischen Feldstimulationselektroden und stellen Sie die Impulse auf 0,5 Hertz mit einer Dauer von 20 Millisekunden ein.
Schalten Sie die ultraschnelle Wellenlängenumschaltlichtquelle ein und stellen Sie sie auf 340 Nanometer und 380 Nanometer schnellen Schaltmodus ein. Wenden Sie eine Belichtungszeit von 20 Millisekunden für beide Wellenlängen und eine Aufnahmezeit von 20 Sekunden an. Nehmen Sie das Video auf, das Echtzeitänderungen von Kalzium transient widerspiegelt, und exportieren Sie die Daten zur Analyse in eine Tabelle.
Humane iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten-Monoschicht wurde für die Messung der Kontraktionsbewegung verwendet. Die Analyse einer Spur der Kontraktionsrelaxationsbewegung mit der Analysesoftware erkannte den Kontraktionsbeginn, den Kontraktionspeak, das Kontraktionsende, den Relaxationspeak und das Relaxationsende. Die vollständige Abdeckung der humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten-Monoschicht wurde auf allen Elektroden innerhalb der Mikroelektroden-Array-Platten beobachtet.
Die von jeder Elektrode aufgezeichneten reifen Wellenformen reflektierten das Herzfeldpotential mit identifizierbaren Eigenschaften. Nach der Analyse wurden Schlagperiode, Feldpotentialdauer und Spikeamplitude ermittelt. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen im aktuellen Klemmmodus zeichneten die spontanen Aktionspotentiale einzelner Kardiomyozyten auf.
Nach der Analyse wurden mehrere Parameter, einschließlich der Amplitude, des maximalen diastolischen Potentials und der Aktionspotentialdauer, erhalten. Nach der Analyse der Kalziumbildgebung wurde das Verhältnis von F340 zu F380 im Laufe der Zeit erhalten, und rohe Spuren stimulierter Kalziumtransienten wurden aufgetragen. Zusätzlich wurden Parameter wie Amplitude, diastolisches Kalzium und Kalziumzerfall Tau erhalten.
Es ist wichtig, die humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten zu verwenden, die sich in guten Schlagbedingungen befinden, sowie die hohe Reinheit der humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten sicherzustellen. Dieses Protokoll umfasst vier spezifische Techniken zur Untersuchung der kardiomyozyten Funktionalität von humanen iPSC, anderer Konfiguration oder automatischer Untersuchung, ob kardiale Ionenströme untersucht werden sollen, die eine entscheidende Rolle bei der kardialen
