Die Autoren danken der Bill und Melinda Gates-Stiftung für die Unterstützung der Technologieentwicklung und Ausbildung.

Hinweis: Dieses Protokoll enthält Volumina und Konzentrationen für 96-Well-Platte, 8er Streifen und Kapillar-basierten Systemen (10 ul Reaktionsvolumen); jedoch HRM auch in 384-Well-Platte-basierten Systemen mit einer 5 &amp; mgr; l Reaktionsvolumen durch eine Skalierung alle Volumes entsprechend durchgeführt werden. Der Erfassungsbereich für die meisten Systeme ist 10 pg bis 10 ng Template-DNA. 1. Bereiten Sie Vorlagen <ol><li> Erhalten Plasmodium falciparum Proben direkt aus dem Blut von Patienten, die an Feldstudien vor Ort erhalten und als Vollblut gespeichert, pelletiert roten Blutzellen oder auf Filterpapier. Bemerkung: Die Proben können auch kultur geeignet ist, in vitro zu wachsen; einige Standard-Laborstämmen für die Analyse von der Malaria-Forschung und Reference Reagent Resource Center (MR4 bestellt werden, können die Proben direkt von pelletierten roten Blutkörperchen oder Kultur verwendet oder aus Vollblut, rote Blutzellen, oder Filterpapier extrahiert werden. </li><li> DNA extrahiert ausFilterpapier oder Kultur-adaptierten Stämme Hinweis: HRM ist empfindlich gegenüber Salzkonzentration; Konzentrationsunterschiede durch variable Extraktionsmethoden kann erhebliche Auswirkungen auf Schmelztemperaturen. Während spezifische endgültigen Puffer nicht ein wesentlicher Faktor für den Erfolg, mit einem Standard-gemeinsame Elution oder Resuspensionspuffer (dh Wasser, 1x Te [&#39;niedrigen Te &quot;oder&quot; DNA Suspensionspuffer&#39;: 10 mM Tris-Cl, 0,10 mM EDTA] oder 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) für alle Proben, um anomale oder inkonsistente Schmelzkurven zu vermeiden. <ol><li> Bereiten Vorlage Verdünnungen von 10 pg -10 ng pro &amp; mgr; l in Standard-Te, TE oder Wasser für jeweils 10 &amp; mgr; l-Reaktion. </li></ol></li><li> Direkte Amplifikation aus pelletierten roten Blutkörperchen <ol><li> Bestimmen Sie Parasitämie von roten Blutzellen unter Verwendung von Dünnschicht-Schmiermikroskopie Hinweis: Methoden zur Bestimmung der Parasitämie der infizierten roten Blutkörperchen sind von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) zur Verfügung: http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Verdünnen Sie Parasitämien über 0,5% 1: 400 in PCR-grade Wasser, TE oder Te. Verwenden Sie 3 ul für jede 5 bis 10 &amp; mgr; l-Reaktion. </li></ol></li><li> Kontrollen Hinweis: HRM können für die Gen-Scan zur Erkennung Sequenzvarianten in einer Population 12 ist; jedoch genaue Genotypisierung erfordert Standards sequenzüberprüft, um die SNP enthalten verhört. Plasmidkonstrukte oder Malaria-Isolaten mit bekannten Genotypen verwendet werden. Für die meisten Anwendungen wird 3D7 (MR4 MRA-151) als Wildtyp-Kontrolle verwendet. Wegen zwischen geführtes Variabilität immer auch positive und negative Kontrollen. <ol><li> Positive Kontrollen: Bereiten Sie 10 pg - 10 ng pro 1 ul-Verdünnungen von Plasmid oder Standards mit sequenzprüft SNP-Genotypen. </li><li> Negative Kontrolle: Verwenden PCR-Wasser als Kontrolle ohne Matrize (NTC) für die Amplifikationsreaktionen. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR-Amplifikation <ol><li> Bereiten Reaktionsgemisch <ol><li> (Optional) Mineralöl-Overlay. Hinweis: Einige HRM-Systeme sind eigenständige Schmelz Plattformen und nicht über eine beheizte Deckel, um Kondensation und Verdampfungsprodukt während der Amplifikation zu verhindern. <ol><li> In 20 ul leichtem Mineralöl in jede Vertiefung Platte vor dem Laden des Reaktionsgemisches. </li></ol></li><li> Bereiten 10x Arbeitsvorräte aller Assays <ol><li> Siehe Tabelle 1 für die empfohlene 10x Arbeitsstamm Konzentrationen sowie Endkonzentrationen für blockierte-Sonde-basierte HRM Genotypisierung. </li></ol></li><li> Bereiten Reaktionsmischungen <ol><li> Zu jeder Vertiefung in der Platte oder ein Rohr, fügen 1 ul 10x Arbeitsstamm Vorwärts- und Rückwärts-Primer und Sonden, von 4,0 bis 5,0 &amp; mgr; 2.5x oder 2.0x HRM Master-Mix, 1 ul Vorlage, und PCR-Wasser für eine Gesamtreaktionsvolumen von 10 &amp; mgr; . </li></ol></li><li> Deckplatten oder Rohre <ol><li> Verwenden Sie optische Platte sAale für plattenbasierte Amplifikation Optokappen für streifenröhrenbasierten Systemen und Kunststoffabdeckungen für die Kapillar-basierten Systemen. Seien Sie sicher, Abdeckung ist komplett und Teller und Deckel sind vollständig versiegelt und gesichert, um Verdunstung während der Amplifikation zu verhindern. </li></ol></li><li> Spin Proben <ol><li> Schleuderplatten 3 min bei 1800 xg, um Luftblasen zu entfernen und abzutrennen Öl- und Wasserphasen, wenn Mineralöl verwendet. </li></ol></li></ol></li><li> Amplifikationsprotokoll <ol><li> Zeigen Reaktionsplatten oder Rohre im Thermocycler. Führen Sie Standard-blockiert-Sonde oder MAAB Amplifikationsprotokolle (Tabellen 2 und 3, respectively). Man beachte den Unterschied in Glühtemperatur zwischen dieser Methoden. </li></ol></li></ol> 3. HRM-Analyse <ol><li> Schmelze <ol><li> Nach der PCR-Amplifikation, fahren Sie mit Schmelzanalyse. Für Standalone-Schmelzanlagen, die nicht integrierte Verstärkung haben (z. B. BioFire Defense LightScanner Systeme), rebewegen verstärkten Platte von Thermocycler und in HRM Instrument. Von der System-Software-Schnittstelle, schmelzen die Platte 40 bis 80 ° C, beide Sonde und Amplikon Schmelzpeaks zu produzieren. Hinweis: Um das Schmelzen und die Analysezeit zu sparen, kann der Schmelzfenster verkürzt, um Temperaturbereiche decken für nur Sonde oder Amplikon Schmelzregionen werden. Nach dem Schmelzen können die Platten und Röhren wieder eingeschmolzen werden, wenn notwendig, und bei -20 ° C oder 4 ° C gelagert. Shop Glasröhren nur bei 4 ° C in Röhrchen von Rissbildung zu verhindern. </li></ol></li><li> Schmelzanalyse <ol><li> Entfernen Sie negative Proben <ol><li> Innerhalb der Analyse-Software, von der weiteren Analyse Proben, die nicht zu verstärken hat, oder dass weisen gezackte Schmelzpeaks zu entfernen. Hinweis: Nach der Auswahl des Analysemodus für einen einzelnen Durchlauf-Datei, das Gerät automatisch Gruppen die positiven und negativen Proben. Vor Genotypisierung jeder Teilsatz kann der Benutzer manuell die Anrufe zu ändern. <ol><li> Entweder aus dem SchmelzKurve oder Schmelzpeak Ansicht mit der rechten Maustaste auf den Kurven entfernt werden, um sie auszuwählen. Nach der Auswahl der Proben falsch klassifiziert, gehen Sie auf &quot;Neuer Anruf&quot;, wählen Sie die entsprechende Gruppierung, und klicken Sie auf &quot;Änderungen übernehmen&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Normalisieren <ol><li> Von der negativen Ableitung des normalisierten Fluoreszenz bezüglich der Temperatur (-dF / dT) (&quot;Difference Curves &#39;) Ansicht fahren Normalisierung Bars, um die Sonde zu umgeben schmelzen Region. Anmerkung: Die Sonde Schmelzbereich ist die niedrigere Temperatur der zwei Schmelzbereiche. Die Normalisierungsstäbe sollte an der Basis des Schmelzpeaks sein. </li></ol></li><li> Berechnen Gruppen <ol><li> Nach der Normalisierung, wählen Sie &quot;Gruppen berechnen &#39;, um automatisch Proben zu Gruppen zuweisen. Falls erforderlich, manuell an bestimmte Gruppen neu zuweisen Proben. Hinweis: Einige Analysesoftware hat eine hohe Empfindlichkeit Schwellenwerte, die nicht geändert werden können; in diesen Fällen wird die software könnten Proben zu verschiedenen Gruppen, die optisch zu einem anderen gehören, zuzuordnen. </li></ol></li><li> Weisen Sie Genotypen <ol><li> Weisen Sie Genotypen für jede Gruppe auf Basis von Standards (Positivkontrollen). <ol><li> Nachdem der Benutzer bestätigt, dass die berechneten Gruppen richtig sind (wenn nicht, dass die richtigen Änderungen wurden auf der Registerkarte Gruppierung indem Sie falsch klassifiziert Proben und die Auswahl der richtigen Gruppe aus dem Dropdown-Feld neben &quot;Neuer Anruf&quot; gemacht), wählen Sie &quot;Gruppennamen ändern &quot;unter der Registerkarte&quot; Gruppieren &quot;. </li><li> Geben Sie die Genotypen der Normen in das entsprechende Farbfeld (zum Beispiel, wenn Standard-3D7 hat einen bekannten Genotyp und ist in der roten Gruppe hat der roten Gruppe Genotyp A). Drücken Sie &quot;OK&quot; und speichern Sie die Ergebnisse. </li></ol></li></ol></li><li> Export-Ergebnisse <ol><li> Export-Genotyp nennt als eine Tabellenkalkulation für die weitere Probenpopulation Analyse. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kontinuierliche HRM ist eine Post-PCR-Analyseschritt; daher ist Proben- und Testaufbau ähnlich wie Standard-PCR-Protokollen, wobei der zusätzliche Einbau einer fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff verwendet, um den Übergang von der Spur doppelsträngigen zu einzelsträngigen DNA während der hochauflösenden Schmelzschritt. Der wichtigste Faktor für eine erfolgreiche HRM-Analyse ist eine robuste PCR-Produkt. Assay-Design ist der Schlüssel, und einige Werkzeuge für die HRM-Assay-Design optimiert sind im Handel und Online-13 zur Verfügung. Amplicon Längen von 80 bis 150 Basenpaaren mit begleitenden ~ 20 Basenpaar blockiert Sonden über den SNP oder SNP von Interesse funktionieren am besten zentriert um SNPs sowie Haplotypen von mehreren SNPs innerhalb der Sonde Region unterscheiden. Sonden können entweder unter Verwendung eines 3&#39;-C3 Spacer oder eine 2-Basenpaar-Fehlpaarung am 3&#39;-Ende, die Verlängerung während der Amplifikation zu verhindern, blockiert werden. Sonden entwickelt, um die Watson und Crick Matrizenstrang angepasst werden; die Wahlhängt von empirischen Tests, um festzustellen, welche Sondendesign akzeptablen Schmelzpeaks erzeugt. Überschüssige Vorwärts- oder Rückwärts-Primer werden verwendet, um einzelsträngige Amplifikationsprodukt, die den blockierten Sonden hybridisiert herzustellen. Wenn die Sonde die Vorwärtsstrangsequenz enthält, dann Reverse-Primer im Überschuß eingesetzt, typischerweise in einem 1: 5-Verhältnis, und umgekehrt für Sonden, die die Rückwärtsstrang entsprechen. Ähnlich funktioniert HRM besten mit ausreichender und robuste PCR-Produkt. PCR-Reaktion Optimierung erfordert Gradienten PCR und Agarose-Gelen oder Bioanalyzer-Analyse, um eine optimale Annealing-Temperaturen zu bestimmen. Template-Konzentration kann mit Methoden wie Vorverstärkung, voreingenommen Multiplex-Amplifikation von allen Zielen mit niedrigem Primerkonzentration und Zyklenzahlen, um die Vorlage 13 zu erhöhen Konzentration erhöht werden. Nur eine Handvoll Instrumente sind mit MAAB kompatibel. Die thermischen Eigenschaften der Glaskapillaren Röhren in Diese Systeme erleichtern dieses Verfahrens. Die kleine Innendurchmesser der Kapillaren sowie die schnelle Wärmeübertragung durch Glas bieten strengere Temperaturregelung als Standard-PCR-Kunststoffprodukte, die langsameren Übergangsraten zwischen Tempern und Denaturierung Zyklen aufgrund der thermischen Isolationseigenschaften der Kunststoffe hat. Mit dieser Methode Detektionsempfindlichkeiten kann von 2-5% auf weniger als 1% eines mutierten Allels in einer Mischung von Wildtyp und mutierten Allele 10 reduziert werden. HRM ist eine einfache, effiziente und wirtschaftliche Werkzeug für die SNP-Genotypisierung in einer Vielzahl von Einstellungen und zahlreiche Anwendungen, von infektiösen Krankheitsüberwachung, um das Scannen für Krebs-Gen-Varianten. Mehrere andere Instrumente, wie die Roche LightCycler Nano und Systeme (480 und 96) sowie die Eco Real-time PCR-System bieten HRM zusätzlich zu den Standard-Amplifikation in Echtzeit, und die Kopienzahl-Funktionalität. Durch höhere Durchsatzmaschinen, kostet HRM Barcoding less als $ 0.50 pro Assay in unseren Händen, mit allen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. In dem hier beschriebenen Zusammenhang Feld-basierten Anwendungen ermöglichen Echtzeit-Überwachung für die Bevölkerung ändert sich mit Malaria-Kontrolle Bemühungen, einschließlich reduzierten Bevölkerungsvielfalt, Erkennung von Parasit-Typen, und das Auftreten und die Ausbreitung von SNPs mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten assoziiert. Verfeinerungen der Methode bieten zusätzliche Empfindlichkeit nützlich für die Unterrichtung Fortschritte Malaria Elimination und Tilgung.

Trotz erneuten Interesse an Malaria Kontrolle und Tilgung bleibt Malaria eine weltweite Belastung, mit fast die Hälfte der Weltbevölkerung dem Risiko einer Infektion und mehr als 550.000 Todesfälle pro Jahr, vor allem Kinder in Afrika südlich der Sahara 1. Diese neuen Bekämpfungs- und Tilgungsprogramme wurden von der genomischen Renaissance unterstützt wurde, mit einer großen Zahl von Malaria-Parasiten sequenziert und auf Mutationen mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten assoziiert analysiert, erhöhte Virulenz und für Bevölkerungsmerkmale 2,3. Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) gehören zu den am häufigsten identifizierten genetischen Varianten 4-7. Tragbare SNP-Genotypisierung Methoden bieten Vor-Ort-und Echtzeit-Bevölkerungsüberwachung und Tracking-8. Neben den Fingerabdrücken einzelnen Parasiten wird der &#39;molekularen Barcode &quot;auch verwendet, um dramatische zeitliche Verschiebungen in Allelfrequenz erkennensowie Varianz effektive Populationsgröße und Komplexität der Infektion 9. Während diese Reihe von informativen SNPs ist leicht zu vielen Genotypisierung Plattformen angepasst, hochauflösende Schmelz (HRM), um feldbasierte Studien, in denen empfindliche und einfache Bedienung und Detektion von neuen Mutationen zu geringen Kosten im Vergleich zur Sequenzierung und anderen besonders gut geeignet Analyse Ansätze sind attraktiv in einem ressourcenarmen Umfeld. HRM beginnt mit Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die einen Fluoreszenzfarbstoff enthält. Post-PCR-Schmelzanalyse bestimmt die Spitzen Amplikon Schmelztemperatur; eine einzige SNP Unterschied in einer kurzen Amplikon kann zu erheblichen Spitzenschmelztemperatur (Tm) Differenzen ergeben. Mehrere Verfeinerungen dieser Methode bieten bessere Genotypisierung Entschließung SNPs einschließlich Klasse IV (AT) SNPs in Proben mit Mehrfach vorliegenden Allele zu unterscheiden und zu erkennen kleinere mutierten Allelen (PolyGenomic Infektionen). Zunächst werden die Assays nehmen kurze Sonden über den Bereich SNP zentriert zusätzlich zur Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen. Diese blockierten Sonden werden nicht während der PCR amplifiziert, sondern auf die im Überschuss Strang binden aufgrund von asymmetrischen Primerkonzentrationen, welche die Produktion der Sonde-Schablonenprodukt erhöhen. Diese separaten Doppelstrang-Amplikons aus Sonde, um das überschüssige Matrizenstrang gebunden sind ~ 20-30 bp; ihrer Länge deutlich zurückgegangen im Vergleich zu den gesamten Amplikons (80-150 bp) führen zu wesentlich größeren Tm Differenzen mit einzelnen oder mehreren Basissonde-Vorlage zugeordnet Material stimmt nicht 10. Zweitens Mutantenallel amplification bias (MAAB) senkt die Reaktions Glühtemperatur zum Vorspannen der Reaktion in Richtung auf niedrige Verhältnisse in polygenomic Infektionen vorliegenden mutierten Allelen. Die Glühtemperatur zwischen den Tms von perfekt aufeinander abgestimmt (Wildtyp) und übereinstimmende (Mutante) Sondensatzs. Bei dieser Temperatur wird die Bindung des Wildtyp-Allels ist stabil genug, dass die Amplifikation im Vergleich zu ihrer Fehlanpassung gleichwertig behindert, wodurch das Vorspannen des Verstärker Richtung des mutierten Allels, wenn beide in einer einzigen Probe 10 vorhanden sind. Mit diesen HRM Ausgestaltungen ist diese Technologie Nachführung Ursprung und die Identität des Parasiten mit epidemischen Infektionen in Südamerika 11 und Erkennung von neuen Mutationen, Differenzierung mehrerer SNPs unmittelbar nebeneinander in der Reihenfolge, und Mutationen assoziiert sind, vorhanden in weniger als 1 erlaubt % der Allele in Proben polygenomic 10. Erhöhte Empfindlichkeit ist besonders wichtig in Regionen nähern Pre-Elimination-Status und die an der Gefahr für die Schwellen Resistenzen. Die Fähigkeit, schnell und einfach zu identifizieren importiert Parasiten und SNPs mit reduzierter Empfindlichkeit vor Ort assoziiert informiert Überwachungsbemühungen und Steuerprogramme zudie Wirksamkeit ihrer Implementierungen und identifiziert Hotspots für erhöhte Malariabekämpfung und Beseitigung Bemühungen. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden für die blockierten-Sonde-basierte und MAAB für erhöhte HRM Genotypisierung Empfindlichkeit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Trotz jahrzehntelanger Bemühungen Tilgung bleibt Malaria eine globale Belastung. Neueste erneutes Interesse an regionalen Eliminierung und weltweiten Abschaffung durch erhöhte genomische Informationen über Parasit Plasmodium Arten von Malaria verantwortlich, darunter Merkmale der geographischen Populationen sowie Varianten mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Anti-Malaria-Medikamenten assoziiert begleitet. Eine häufige genetische Variation, Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), bietet attraktive Ziele für Parasiten Genotypisierung. Diese Marker sind nicht nur für die Verfolgung von Drogenresistenzmarker, sondern auch für die Verfolgung von Parasitenpopulationen mit Markern nicht unter Drogen oder andere Selektionsdruck. SNP-Genotypisierung Methoden bieten die Möglichkeit, Resistenzen zu verfolgen als auch auf einzelne Parasiten für Bevölkerungsüberwachung Fingerabdruck, insbesondere als Reaktion auf die Bekämpfung von Malaria Bemühungen in Regionen kurz vor EliminatIonen-Status. Während informative SNPs wurden identifiziert, agnostisch, spezifische Genotypisierung Technologien sind, ist hochauflösenden Schmelz (HRM) Analyse besonders geeignet zu Feld-basierte Studien. Im Vergleich zu Standard-Fluoreszenzsonde basierte Methoden, die einzelne SNPs in einem einzigen markierten Sonde erfordern und bieten im besten Fall 10% Sensitivität gegen SNPs in Proben, die mehrere Genome (polygenomic) enthalten, zu erkennen, bietet HRM 2-5% Sensitivität. Modifikationen HRM, wie blockierte Sonden und asymmetrische Primerkonzentrationen sowie die Optimierung der Amplifikation Glühtemperaturen vorzuspannen PCR zur Amplifikation der kleinere Allel, die Empfindlichkeit des HRM weiter zu erhöhen. Während die Empfindlichkeitsverbesserung hängt von den spezifischen Assay haben wir Detektionsempfindlichkeiten auf weniger als 1% der kleinere Allel erhöht. In Regionen nähern Ausrottung der Malaria ist die frühzeitige Erkennung aufkommender oder importierte Arzneimittel-Resistenz wichtig für prOmpT Antwort. In ähnlicher Weise kann die Fähigkeit, polygenomic Infektionen zu erkennen und zu differenzieren Parasit Typen aus kryptischen lokalen Reservoirs Steuerprogramme zu informieren. Dieses Manuskript beschreibt Änderungen an hochauflösende Schmelztechnologie, die die Empfindlichkeit weiter zu erhöhen, um polygenomic Infektionen in Patientenproben zu identifizieren.

Daten können auf verschiedene Weise sichtbar gemacht werden, abhängig von der Analyse-Software und Geräte. Typischerweise ist eine graphische Darstellung der negativen Ableitung der normalisierten Fluoreszenz bezüglich der Temperatur (-dF / dT) gegen die Temperatur ergibt einfachste zur Visualisierung Schmelzpeaks und Bestimmen Genotypen. Ein vollständiges Schmelzen Fenster (40 ° C-80 ° C) wird in beiden Amplikon und Sondenschmelzbereichen führen. 1 zeigt ein Beispiel eines normierten Schmelzpeaks für die beiden Regionen. Einstellung des Analysefenster, um nur den Sondenbereich führt zu klaren Differenzierung von Peaks, die bestimmte SNPs (Abbildung 2). Sondenbasierte Analyse zeigt deutlich die Anwesenheit beider Allele als Einzelpeaks bei Schmelztemperaturen, die homozygot SNP Peaks (Figur 3) entsprechen. 4 zeigt, dass progressidie Glühtemperatur während der Amplifikation (MAAB) Ergebnisse vely Verringerung in einer Ausrichtung auf das mutierte Allel (linksseitiger Peak) (4A), was zu einer erhöhten Empfindlichkeit des mutanten Allels in einer Population von gemischten Allele (4B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Abbildung 1. Probe und Amplikon Schmelz Regionen. Die Auftragung der negativen Ableitung des normalisierten Fluoreszenz bezüglich der Temperatur über einen weiten Schmelz Fenster Ergebnisse sowohl Sonde (niedriger Temperatur) und Amplikon Schmelzpeaks, die analysiert werden können. (Angepasst von Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2. Sondenschmelzpeaks. Perfekt Spielen (in der Regel Wildtyp-Allele) führen zu höheren Schmelzpeaks (rot), während SNP Fehlanpassungen haben niedrigere Schmelztemperaturen (grau). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Abbildung 3. Polygenomic Schmelzpeaks. Wenn beide Allele in einer Probe vorhanden sind, sondenbasierten HRM-Analyse stellt beide Allele als Zwei-Peak-Kurven (orange) mit Gipfeln, die Single-Allel Proben (rot und grau) entsprechen. (Angepasst von Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere v ansehen</a>ersion dieser Figur. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Abbildung 4. Mutant Allel amplification bias (MAAB). A. Schrittweise Absenken der Verstärkung Glühtemperatur spannt die Schmelzpeak-Reaktion in Richtung Spitze entsprechend der Mutante (niedrigere Temperatur) Allels in einer polygenomic oder polyallelic Probe. B. MAAB führt HRM Empfindlichkeit bei weniger als 1% in polygenomic oder polyallelic Proben vorhanden kleinere Allele zu erkennen. (Teil B angepasst von Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Tabelle 1 Set-up der Sonde-basierte hochauflösende Schmelz Amplifikationsreaktionen. <table><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen pro reAktion (96-Lochplatte und ein Kapillarrohr) </td><td> Volumen pro Reaktion (384-Well-Platte) </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4-5 &amp; mgr; </td><td> 2-2,5 &amp; mgr; </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x Überschüssiger Primer </td><td> 1 &amp; mgr; </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,50 &amp; mgr; M </td></tr><tr><td> 10 x Andere Primer </td><td> 1 &amp; mgr; </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,1 &amp; mgr; M </td></tr><tr><td> 10x-Sonde </td><td> 1 &amp; mgr; </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,40 &amp; mgr; M </td></tr><tr><td> PCR-grade Wasser </td><td> 1-2 &amp; mgr; </td><td> 0,5-1 &amp; mgr; </td><td></td></tr><tr><td> Templat-DNA </td><td> 1 &amp; mgr; </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,01-10 ng / ul </td></tr><tr><td></td><td> 10 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Standard hochauflösende Schmelz Amplifikationsbedingungen. <table><tbody><tr><td> Temperatur </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 Zyklen </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 Zyklus </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sec </td></tr></tbody></table> * Diese Temperatur Amplikon-abhängige Tabelle 3. Amplification Bedingungen für mutierte Allel amplification bias. <table><tbody><tr><td> Temperatur </td><td> Zeit </td><td> Fahrräder </td><td> Anstiegsgeschwindigkeit </td><td> Erfassungsmodus </td><td> Analysemodus </td></tr><tr><td> Denaturieren </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Keine </td&gt; <td> Keine </td></tr><tr><td rowspan="2"> Fahrrad fahren </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sec </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Keine </td><td rowspan="2"> Quantifizierung </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sec </td><td> 20 </td><td> Single </td></tr><tr><td rowspan="3"> Schmelze </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sec </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0,3 </td><td> Keine </td><td> Keine </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sec </td><td rowspan="2"> Kontinuierliche </td><td rowspan="2"> Schmelze </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sec </td></tr></tbody></table> * Diese Temperatur Amplikon abhängig und wird bei der Durchführung MAAB reduziert werden

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Während eine hohe Auflösung Schmelzanalyse bietet die Möglichkeit, zwischen den Single Nucleotide Polymorphismen in einer heterogenen Population zu unterscheiden, können mutante Allel amplification bias seine Fähigkeit, bei relativ niedrigen Prozentsätzen in einer Probe vorhandenen Allele detektieren erhöhen. Dieses Protokoll beschreibt Verbesserungen, die die Empfindlichkeit der hochauflösende Schmelzanalyse zu verbessern.

Methoden, um die Sensitivität der High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotypisierung in Malaria erhöhen

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Aufrufe.  Harvard University.  Während eine hohe Auflösung Schmelzanalyse bietet die Möglichkeit, zwischen den Single Nucleotide Polymorphismen in einer heterogenen Population zu unterscheiden, können mutante Allel amplification bias seine Fähigkeit, bei relativ niedrigen Prozentsätzen in einer Probe vorhandenen Allele detektieren erhöhen. Dieses Protokoll beschreibt Verbesserungen, die die Empfindlichkeit der hochauflösende Schmelzanalyse zu verbessern. 

Serie: Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

2D und 3D Chromosom Malerei in Malaria-Mücken

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Hohe Auflösung Elektronenmikroskopie der<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Typ IV-Sekretionssystem Pili Produziert in variierenden Bedingungen von Iron Verfügbarkeit

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...