Dieses Protokoll dient zum Schneiden und Kultivieren von Herzgewebeabschnitten für sechs Tage unter physiologischen Bedingungen, die für akute Kartotoxizitätstests sowie zur Prüfung der Wirksamkeit von Herzinsuffizienztherapien verwendet werden können. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute kardiale Toxizitätstests zu werden, das die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen schließt. Demonstriert die Verfahren wird Qinghui Qu, ein Laborleiter aus unserem Labor.
Um Schweineherzgewebescheiben zu erhalten, fügen Sie zuerst Eis in die Gewebebade-Kühljacke eines Vibrames und Tyrode-Lösung in das Bad. Verwenden Sie ein ein Liter Plastikglas, um den geschmolzenen Eisablauf aus der Kühljacke des Gewebebades zu sammeln und das Schweineherz in ein Tablett mit einem Liter frischer, kardiver mittelsemitzenischer Lösung in einem Biosicherheitsschrank zu übertragen. Verwenden Sie versenkbare sterile Skalpelle, um das Herz zu sezieren, um den linken Ventrikel zu isolieren und verwenden Sie rechteckige Rasierklingen, um den linken Ventrikel in ein bis zwei Würfelzentimeterblöcke zu schneiden.
Legen Sie einen Gewebeblock zum Schneiden beiseite und legen Sie die restlichen Gewebeblockstücke in ein 50-Milliliter-Rohr kalter Tyrode-Lösung auf Eis. Massieren Sie den reservierten Gewebeblock vorsichtig und fügen Sie dem Metallprobenhalter des Vibratome einen bis zwei Tropfen Gewebekleber hinzu. Stecken Sie ein Stück 4%Agar-Block mit einer Oberfläche von etwa einem Quadratzentimeter auf den Kleber und fügen Sie ein bis zwei Tropfen Gewebekleber auf den Agar.
Befestigen Sie den Herzblock an der Agar-Herz-Epikardie-Seite mit dem Gewebe so flach wie möglich gegen den Halter und legen Sie den Gewebehalter mit dem Herzblock in das Schnittbad des Vibratome. Es ist wichtig, den Herzblock an den Agar mit der Herz-Epikardie-Seite nach unten auf den Gewebekleber zu kleben und sicherzustellen, dass das Gewebe so flach wie möglich ist. Befestigen Sie dann das Sauerstoffrohr am Schneidbad und am mit Tyrode-Lösung gefüllten Metalltablett und legen Sie 40 Mikrometer-Zellsiebe auf die Metallschale, um die Herzgewebeabschnitte zu sammeln, während sie in Scheiben geschnitten werden.
Verwenden Sie die Vibratom-Bediensoftware, um die Höhe der Klinge und der Probe so einzustellen, dass die Klinge nahe an der Oberseite des Gewebes ist, aber unter den Papillarmuskeln und Flüssigkeit das Gewebe und die Klinge bedeckt. Wählen Sie Advance aus, um die Stelle anzupassen, an der das Gewebe zu schneiden beginnt. Drücken Sie die Scheibe, um die Geschwindigkeit zu erhöhen, und verwenden Sie den Knopf, um die Klinge in Richtung der Kante des Gewebes zu bewegen.
Drücken Sie erneut auf Slice, um den Vorgang zu stoppen und zu deaktivieren. Passen Sie dann die Schnittparameter wie angegeben an und drücken Sie die Scheibe, um mit dem Schneiden des Gewebes zu beginnen. Wenn die Klinge das Ende des Gewebes erreicht, aber bevor sie das Ende des Probenhalters trifft, drücken Sie erneut die Scheibe, um anzuhalten, und drücken Sie zurück, um zur Startposition zurückzukehren.
Wenn die Scheiben die volle Länge erreichen und von guter Qualität zu sein scheinen, verwenden Sie eine Pasteur-Kunststoff-Pipette, die mit kalter Tyrode-Lösung gefüllt ist, um das Gewebe aus dem Bad vorsichtig mit Zangen und Federscheren zu sammeln, um die Scheibe bei Bedarf aus dem Herzen zu entfernen. Legen Sie jede gesammelte Scheibe in ein einzelnes Zellsieb im sauerstoffhaltigen Tyrode-Bad und verwenden Sie die Lösung in der Pipette, um das Gewebe auf die Zellsieboberfläche zu drücken. Legen Sie dann eine Metallscheibe auf die Oberseite des Gewebes, um es zu halten.
Nach mindestens einer Stunde in sauerstoffhaltiger Tyrode-Lösung die Außenseite jeder Scheibe schneiden, um unebene Kanten zu entfernen und das Ende jeder Scheibe auf ein sechs Millimeter breites Stück sterilisierten Polyurethan-Drucker-Zahnriemen mit eingebetteten Metalldrähten zu kleben. Legen Sie die unterstützten Herzscheiben in sechs-Well-Platten mit sechs Milliliter Kulturmedium pro Brunnen und verwenden Sie sterile Zangen, um sicherzustellen, dass das Gewebe in der Mitte des Brunnens ist. Achten Sie darauf, dass die Plattenabdeckung das Gewebe nicht berührt und die Platte auf die Kulturplatte aufgibt, so dass die gekrümmte Seite der Plattenabdeckung mit der abgewinkelten Seite der Platte übereinstimmt und sich die quadratischen Ecken anrichten.
Legen Sie die Scheiben in einen 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie die Kulturüberstandmittel dreimal täglich durch sechs Milliliter frisches sauerstoffreiches Kulturmedium. Schließen Sie die Abdeckung an den elektrischen Stimulator der Zellkultur an und stellen Sie den Stimulator so ein, dass er kontinuierlich 10 Volt Strom und eine 1,2-Hertz-Frequenz an die Herzscheiben liefert.
Nach dem Einstecken der Stimulation beginnen die Herzscheiben zu schlagen. Jeden Tag während des Mittags-Medienwechsels die Stimulationsplattenabdeckung aus der Kulturschale ersetzen, um die Freisetzung giftiger Graphitpartikel in das Kulturmedium zu verhindern. Setzen Sie den weißen Schaumstoffstecker ein, an dem die verwendete Abdeckung mit dem Kabel für den elektrischen Stimulator der Zellkultur verbunden ist, um Wasserschäden am Stromkreis zu verhindern, und legen Sie die Plattenabdeckung in ein Bad aus autoklaviertem Wasser, das mit 2X Antibiotikum/Antimykotik ergänzt wird.
Am nächsten Tag dekontaminieren Sie die Plattenabdeckung in einem 70%ethanol Bad für fünf bis 15 Minuten, bevor Sie die Abdeckung in ein frisches autoklavisches Wasserbad übertragen, das drei Minuten lang mit 2X Antibiotikum/Antimykotik ums Leben kam. Nach dem Spülen der Plattenabdeckung verwenden Sie ein mit Ethanol gesprühtes sauberes fusselfreies Tuch, um Restwasser aus den Kunststoffteilen zu entfernen und den weißen Schaumstoffstopfen zu entfernen. Die Abdeckung ist dann bereit, wieder in die Kulturplatte gelegt werden.
Mit diesem neuen biomimetischen Kultur-Setup, wie gezeigt, Schweineherzscheiben Lebensfähigkeit wurde für sechs Tage beibehalten, wie durch MTT-Assay bewertet. In den ersten sechs Tagen, ähnlich wie bei frischen Herzscheiben, gibt es keine spontanen Kalziumtransienten in der Schweineherzscheibe Kardiomyozyten. Die Kardiomyozyten reagierten auf externe elektrische und beta-adrenerge Stimulation.
Darüber hinaus wurden die kontraktile Kraft und die Reaktionen auf Isoproterenol in der Herzscheibenkultur für bis zu sechs Tage ähnlich der in frischen Herzscheiben beobachtet gehalten. An den Herzscheiben können mehrere strukturelle und funktionelle Bewertungen durchgeführt werden, einschließlich MTT-Lebensfähigkeitstests, Immunfärbung, Elektronenmikroskopie, Kalziumtransientenmessungen, kontraktilen Funktionsbewertungen, metabolischen Bewertungen und Analysen. Wir nutzen dieses Kultursystem derzeit, um die akute Kardialtoxizität und Wirksamkeit von Medikamenten und Gentherapien zu testen, die für Schweine- und menschliche Herzscheiben von Interesse sind.
