Diese Studie ist ein einfaches, vielseitiges und einfaches System, um verschiedene photodynamische Effekte auf verschiedene Mikroorganismen und Zellen zu untersuchen. In diesem System kann die LED je nach Versuchsdesign unterschiedlich angeordnet werden. Verschiedene Bedingungen der PDT können in einer 96-Well-Platte oder sogar einer 384-Well-Platte in einem Experiment berechnet werden.
Diese Technik kann zur Behandlung von Pilzkeratitis eingesetzt werden, wodurch weltweit rund 150.000 Menschen trotz intensiver Behandlungen ihre Augen verlieren. Schneiden Sie zunächst vier grüne LEDs aus einem LED-Streifen und richten Sie sie mit drei Vertiefungen einer 96-Well-Platte aus. Messen Sie die Fluenzrate der LED bei 540 Nanometern mit einem Lichtleistungsmesser.
Halten Sie die Temperatur konstant bei 25 Grad Celsius mit einem elektrischen Lüfter, der während der Bestrahlung neben der Platte montiert wurde. Mit einer sterilen Schlaufe eine einzelne Kolonie Candida albicans aus einer Agarplatte entnehmen und in ein sterilisiertes Glasröhrchen mit drei Millilitern YPD-Medium geben. Inkubieren Sie das Rohr bei 25 Grad Celsius bei einer Drehzahl von 155 U / min für 14 bis 16 Stunden, um die Hefekultur zu züchten.
Als nächstes verdünnen Sie die Übernachtkultur mit YPD medium auf einen OD 600-Wert von 0,5. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius mit einer Rotation bei 155 U / min für vier Stunden, um die Blockwachstumsphase zu erreichen. Wiederholen Sie die Verdünnung der logarithmischen Phasenkultur mit frischem YPD-Medium auf einen OD 600-Wert von 0,65, um etwa ein Mal 10 bis zur siebten koloniebildenden Einheit pro Milliliter zu erhalten.
Bereiten Sie gleichzeitig eine 4%ige Lösung von Rosenbengalen in 1X PBS vor. Filter sterilisieren mit einem 0,22 Mikrometer Filter. Fügen Sie 111 Mikroliter 2% rose bengalische Lösung zu einem Milliliter Log-Phasenkultur hinzu und kokultivieren Sie sie zu verschiedenen Zeitpunkten bei Raumtemperatur, um die Absorption von RB in den Zellen zu verstehen.
Zentrifugieren Sie bei 16, 100 x G für 2 1/2 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie die Co-Kultur dreimal mit einem Milliliter 1X PBS. Nach dem Waschen die Candida albicans-Kultur in einem Milliliter 1X PBS aussetzen. Verteilen Sie die Kultur für jede Bedingung in drei verschiedene Vertiefungen in einer 96-Well-Platte.
Richten Sie die Vertiefungen am LED-Array aus. Schalten Sie in den lichtexponierten Gruppen den elektrischen Lüfter ein und leuchten Sie. Führen Sie nach der Bestrahlung zweimal zehnfache serielle Verdünnungen durch, indem Sie 20 Mikroliter der Co-Kulturlösung aus einer Vertiefung entnehmen und in ein Röhrchen mit 180 Mikrolitern 1X PBS geben.
Lassen Sie dann 20 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung in einem Quadranten einer YPD-Agarplatte fallen, um zählbare Kolonien auf der Platte zu erhalten. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine sofortige Färbung von Candida albicans mit Rosenbengalen unter roter Fluoreszenz. Nach 15 Minuten Inkubation wurden die meisten Zellen mit Rosenbengalen gefärbt, was darauf hindeutet, dass sie zeitabhängig in die Zellen gelangen.
Darüber hinaus erzeugt die Aktivierung von Rosenbengalen mit Licht freie Radikale und Singulett-Sauerstoff in den Zellen, was zum Zelltod führt. In Abwesenheit von Rosenbengalen oder Bestrahlung wurde kein Zelltod beobachtet. Candida albicans wurde nach Bestrahlung mit grünem Licht in Gegenwart von 0,2% Rosenbengalen in einer lichtdosisabhängigen Weise gehemmt.
Es ist wichtig, dass zuerst die 96-Well-Platte mit der Mitte der LED ausgerichtet werden muss. Zweitens muss die verwendete Agarplatte gründlich getrocknet werden, um die Vermischung getrennter Kolonien zu verhindern. Die Candida albicans, die auf dem Teller gewachsen sind, können weiter zur Genanalyse geschickt werden, die beantworten kann, wie PDT die Genexpression der Zellen beeinflusst.
Diese Techniken ebnen den Weg, um zu untersuchen, wie PDT auf verschiedenen Zelltypen funktioniert, entweder Krebszellen, Bakterien, Pilze oder Viren mit einer einfachen, kostengünstigen und vielseitigen Plattform.
