Unser Protokoll ist mit anderen molekularen Analysemethoden kompatibel und ermöglicht die Beurteilung, wie Medikamente die Lebensfähigkeit von in-Takt-Gewebescheiben und die Leistung eines mittleren Durchsatz-Screenings beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir die Lebensfähigkeit einer ganzen Gewebescheibe in Echtzeit mit sehr wenig Vor- oder Nachbearbeitung messen können. Diese Technik beschleunigt die präklinische Arzneimittelentwicklung und Onkologie, indem sie Wirkstoffkandidaten oder Gewebescheiben testet, die direkt aus Tumorgewebeproben von Patienten erworben wurden.
Unsere Echtzeit-Methode zur Beurteilung der Gewebelebensfähigkeit ist sehr vielseitig und kann auf Krebsbiologie-, Neurowissenschaften und Entwicklungsbiologie-Studien angewendet werden. Die Vorbereitung von in-taktfähigen, lebensfähigen Gewebescheiben ist der Schlüssel zum Erfolg des Verfahrens. Die Vibratome-Einstellungen in mittlerer Zusammensetzung sollten je nach Gewebetyp und Festigkeit angepasst werden.
Am Tag der Tumorgewebescheibenerfassung, aliquot 250 Mikroliter Gewebescheibenkultur medium pro Brunnen in einer 24 Brunnenplatte und legen Sie einen Gewebekultureinsatz in jeden Brunnen. Dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator mit fünf Prozent Kohlendioxid bis zur Verwendung. Um Tumorgewebefragmente zu erfassen, tauchen Sie das Tumorgewebe in eiskalte HBSS in eine 10-Zentimeter-Kulturplatte und verwenden sie mit einem Skalpell, um das Gewebe zu halbieren.
Verwenden Sie einen sechs Millimeter großen Biopsie-Punch, um Zylinder des Tumorgewebes zu erfassen und ein Ende jedes Zylinders zu trimmen, um eine flache Oberfläche zu schaffen. Legen Sie die Gewebeteile in frische, eiskalte HBSS und schalten Sie ein Vibratome ein. Desinfizieren Sie alle Geräte mit siebzig Prozent Ethanol und stellen Sie die vibratome Pufferschale, die mit einem Acrylglasdeckel bedeckt ist, in die Mitte des Vibratome-Eisbades.
Eis ins Bad geben, puffert mit kaltem HBSS füllen. Laden Sie eine Rasierklinge in den Klingenhalter und verwenden Sie Zahnzangen, um sorgfältig eine biopsiegessgestanzte Tumorprobe auszuwählen. Fügen Sie einen Tropfen medizinischer Cyanoacrylatkleber auf die Probenplatte.
Das Gewebe auf ein Blatt fusselfreies Papiertuch ziehen, um überschüssigen Puffer zu entfernen und den Gewebezylinder in einer aufrecht stabilen Position auf den Tropfen zu montieren. Nach zwei bis drei Minuten Lufttrocknung die Platte in die Pufferschale geben und zusätzliche HBSS in das Fach geben, bis das Gewebe vollständig in den Puffer eingetaucht ist. Dann montieren Sie das Vibratome, indem Sie die Eisschale und Pufferschalenmontage auf das Vibratome legen und den Arm verriegeln.
Stellen Sie die Schnittdicke von Vibratome auf 250 Mikrometer, die Amplitude auf drei Millimeter, die Schnittgeschwindigkeit auf 0,01 bis 0,25 Millimeter pro Sekunde und den Klingenwinkel auf 15 bis 21 Grad. Legen Sie die Start- und Endpositionen des Blatts fest, und passen Sie die Höhe der Bühne an. Führen Sie das Gerät im kontinuierlichen Modus aus, um Scheiben für mehrere Zyklen zu schneiden, bis das Gewebe gleichmäßig geschnitten wird.
Verwenden Sie eine breite Spitze Transfer Biped, um die Scheiben und eine kleine Menge von HBSS in einzelne ZellkulturEinsätze in jedem Brunnen der zuvor vorbereiteten 24 Well Platte zu übertragen und verwenden Sie eine feine Spitze Transfer Biped, um überschüssigepuffer aus den Brunnen zu entfernen. Wenn das Ende der Probe erreicht ist, montieren Sie ein neues Stück Gewebe und erhalten Sie zusätzliche Scheiben, bis genügend Proben entnommen wurden. Dann kulturieren Sie die Gewebescheiben im Zellkultur-Inkubator für 24 bis 48 Stunden.
Um die Lebensfähigkeit der Gewebescheiben zu messen, bereiten Sie ein auf Lumineszenz basierendes Lebensfähigkeitsmessreagenz vor, das sowohl Luziferase als auch Prosubstrate bei ein- bis tausend Verdünnung in frischem Gewebescheibenkulturmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers enthält, und ersetzen Das Medium in jedem Brunnen der 24 Brunnenplatte durch das Gemisch. Fügen Sie 50 Mikroliter Enzymsubstrat-Mischung auf jede Gewebescheibe und legen Sie die Platte auf einen Orbital-Shaker in einem befeuchteten Inkubator mit sanfter Erregung bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid über Nacht. Messen Sie am nächsten Morgen das Lumineszenzsignal in jedem Brunnen auf einem Mikroplattenleser mit den entsprechenden Einstellungen.
Nach der Bestimmung der Ausgangslebensfähigkeit der Gewebescheiben, lösen Sie die Medikamente von Interesse in GewebescheibenKultur Medium, um 10x Stock-Lösungen zu erhalten und fügen Sie jede 10x Medikament Lösung, um das Kulturmedium an der Unterseite jeder Gewebescheibe gut. Übertragen Sie 50 Mikroliter des Medikaments ergänzt Medium von der Unterseite jedes Brunnens auf jede Gewebescheibe und geben Sie die Scheiben an den Orbital-Shaker über Nacht. Übertragen Sie am nächsten Morgen die Kulturplatte ohne Schütteln in den Subkultur-Inkubator und messen Sie die Lumineszenzintensität in jeder Gewebeprobe auf dem Mikroplattenleser zu den entsprechenden experimentellen Zeitpunkten.
Die Lebensfähigkeit des behandelten Tumorgewebes zu jedem Zeitpunkt kann dann mit der angegebenen Gleichung berechnet werden. Die Lebensfähigkeit der aus einer Maus-Brustkrebs-Tumorprobe hergestellten Gewebescheiben kann mit gelegentlichem mittelmäßigem Austausch mindestens 21 Tage lang aufrechterhalten werden. Die Behandlung mit dem Multikinase-Inhibitor für vier Tage reduziert die Lumineszenzsignalintensität um das 100-fache im Vergleich zu Kontrolltumorgeweben, die mit Dimethylsulfoxid behandelt werden.
Die Behandlung mit der Hälfte der Konzentration desselben Inhibitors verringert die Lumineszenz bereits am ersten Tag und erreicht am vierten Tag den niedrigsten Wert, wobei er für jeden weiteren gemessenen Zeitpunkt niedrig bleibt. Im Gegensatz dazu bleibt die leuchtende Intensität der kontrollierten Tumorgewebegruppe während der sechstägigen Kultur stabil. Darüber hinaus veranschaulicht die Behandlung von Maus-Brustkrebs-Tumorscheiben mit seriellen Dosen des Inhibitors für vier Tage die dosisabhängigen Veränderungen der Slice-Lebensfähigkeit in der halben maximal wirksamen Konzentration des Arzneimittels.
Patienten abgeleitete Xenografts, die mit Doxorubicin, einem Standard-Chemotherapeutikum, behandelt wurden, weisen ebenfalls dosisabhängige Veränderungen der Lebensfähigkeit auf. Darüber hinaus liefern die Tests von siebzehn präklinischen und klinisch zugelassenen Medikamenten in Dreifacharbeit auf Gewebescheiben, die aus einem einzigen, von Patienten abgeleiteten Xenograft hergestellt werden, den Beweis des Konzepts, dass ein Medikament mit mittlerem Durchsatz auf Tumorscheiben mit der nativen Tumormikroumgebung durchgeführt werden kann. Achten Sie bei der Vorbereitung der Tumorgewebeproben darauf, den Kontakt mit den Gewebescheiben zu minimieren, um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden.
Unsere Methode kann mit anderen Ansätzen wie IHC, Durchflusszytometrie oder Einzelzellsequenzierung gekoppelt werden, um räumliche und einzellige Informationen aus dem Gewebe zu erhalten. Unsere Technik ermöglicht das Testen der Auswirkungen mehrerer Medikamente von Interesse in verschiedenen Dosen unter physiologischen Bedingungen im Laufe der Zeit. Bei der Vorbereitung von Gewebescheiben aus Tumoren mit einem unbekannten Krankheitserregerstatus, achten Sie darauf, alle Verfahren in einem Biosicherheitsschrank durchzuführen.
