Dieses Protokoll hat eine hohe Wirkung auf dem Gebiet der Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln, insbesondere bei der Entwicklung neuartiger, erstklassiger Medikamente mit minimalen Nebenwirkungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es auf jedes GPCR-System angewendet werden kann, und verwendet werden, um genaue Informationen über Rezeptor-Pharmakologie in Echtzeit-Lebensysteme zu erhalten. Die Auswirkungen dieser Technik stehen in engem Zusammenhang mit neuen Therapien, insbesondere dort, wo Beta-Arrestine relevant sind.
Dazu gehören Opiod-Rezeptoren bei Schmerzen und Dopamin-Rezeptoren bei Schizophrenie. Diese Methode kann in vielen medizinisch-wissenschaftlichen Forschungsbereichen von der Neurologie bis zur Herz-Lungen-Erkrankung nützlich sein. Die PCR-Demonstration unserer Methode ist wichtig, da sie eine detaillierte Darstellung der kritischen Schritte im Protokoll ermöglicht, was mit einer herkömmlichen Veröffentlichung nicht möglich wäre.
Beginnen Sie mit dem Entwerfen von Primern, um Gene einzuführen, die für die pBiT-Vektoren von Interesse sind. Aufgrund des Inframe-Stop-Codons, das die Multi-Klon-Stelle teilt, wählen Sie mindestens einen der drei Standorte als eines der beiden einzigartigen Restriktionsenzyme aus, die für das richtungsweisende Klonen benötigt werden. Beziehen Sie sich auf das Manuskript für Nukleotidsequenzen, um die Linkerrückstände zu kodieren und in die Primer zu integrieren.
Stellen Sie für pBiT1.1-C und pBiT2.1-C sicher, dass die Vorwärtsgrundierung ein ATG-Codon und eine potente Kozak-Konsenssequenz enthält. Stellen Sie für pBiT1.1-N und pBiT2.1-N sicher, dass die Reverse Primer ein Stop-Codon enthält. Verwenden Sie die entworfenen Primer, um die Insert-DNA des gens von Interesse zu verstärken.
Kombinieren Sie die PCR-Reagenzien nach Manuskriptanweisungen, um eine hochtreue DNA-Polymerase zu verwenden, um Mutationen zu minimieren. Programmieren Sie den Thermocycler und starten Sie die Reaktion. Nach Abschluss der PCR verdauen Sie das Produkt in einer 50-Mikroliter-Verdauungsreaktion.
Kombinieren Sie in einer 1,5-Milliliter-Röhre 12 Mikroliter destilliertes Wasser, fünf Mikroliter des entsprechenden 10-Fach-Restriktionsverdauungspuffers und 30 Mikroliter des PCR-Produkts. Dann fügen Sie 1,5 Mikroliter jedes Restriktionsenzyms hinzu. Wirbel nisch das Reaktionsgemisch.
Und über Nacht bei 37,5 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie eine zweite Reaktion vor, um das Empfängerplasmid zu verdauen. Kombinieren Sie in einer 1,5-Milliliter-Röhre 23 Mikroliter Wasser, fünf Mikroliter des entsprechenden 10-Fach-Restriktionsverdauungspuffers, 15 Mikroliter des Empfängerplasmids und 1,5 Mikroliter jedes Restriktionsenzyms.
Mischen Sie die Röhre kurz. Und über Nacht bei 37,5 Grad Celsius inkubieren. Am Tag nach dem Klonen und der Transformation drei bis zehn einzelne Bakterienkolonien pflücken und auf einen Milliliter LB-Medium mit Ampicillin übertragen.
Inkubieren Sie die Zellen für sechs Stunden. Und dann 200 Mikroliter bakterielle Suspension auf fünf Milliliter frisches LB-Medium mit Ampicillin übertragen. Inkubieren Sie die Kultur bei 37,5 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 Umdrehungen von Morgen über Nacht.
Am nächsten Tag isolieren Sie das Plasmid mit einem Mini-Prep-DNA-Reinigungskit. Überprüfen Sie das gereinigte Plasmid für eine erfolgreiche Ligation mit PCR. Einen Tag vor der Transfektion säen Sie die Zellen auf einer Poly-L-Lysin-beschichteten 96-Well-Platte mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin G und 100 Mikroliter pro Milliliter Streptomycin.
Fügen Sie den 60 Innenbrunnen nur Zellen hinzu, um das Potenzial für thermische Gradienten über die Platte und Kanteneffekte durch Verdunstung zu minimieren. Fügen Sie 200 Mikroliter steriles destilliertes Wasser in die 36 Außenbrunnen und 150 Mikroliter in die Räume zwischen den Brunnen. Dann inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Führen Sie am nächsten Tag die Transfektion mit insgesamt 100 Nanogramm DNA durch. Richten Sie vier verschiedene Plasmidkombinationen nach Manuskriptanweisungen ein. Mit 20 Mikroliter modifizierten Eagle minimalen essentiellen Medien mit HEPES gepuffert, und 0,3 Mikroliter Lipidtransfektion Reagenz pro Brunnen.
Fügen Sie 20 Mikroliter Lipidtransfektionreagenz und DNA-Mischung zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie die Platte in Kreisen für 10 Sekunden. Inkubieren Sie die Platte bei 37,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden. Aktualisieren Sie das Medium.
Und noch 24 Stunden inkubieren. Nach der Inkubation das Medium ansaugen und 100 Mikroliter modifizierter Eagle-Mindestmedien, die mit HEPES gepuffert sind, zu jedem Brunnen hinzufügen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten stabilisieren.
In der Zwischenzeit bereiten Sie das Furimazin-Substrat vor, indem Sie ein Volumen des 100-Fach-Substrats mit 19 Bänden LCS-Verdünnungspuffer kombinieren, wodurch ein 5-facher Bestand entsteht, der mit dem Zellkulturmedium vermischt werden soll. Wenn die Zellen bereit sind, fügen Sie 25 Mikroliter des Bestands zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie die Platte vorsichtig für 10 Sekunden. Messen Sie dann die Lumineszenz für 10 Minuten bei Raumtemperatur für die Signalstabilisierung.
Für Experimente mit Ligand-Zugabe bereiten Sie die 13,5-fache Ligandenlösung in modifizierten Eagle-Mindestmedien vor, die mit HEPES gepuffert wurden, und fügen Sie 10 Mikroliter pro Brunnen mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Dann mischen Sie die Platte von Hand oder mit einem Orbital-Shaker. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Wechselwirkungen zwischen einem prototypischen GPCR und zwei Beta-Arrestin-Isoformen zu untersuchen.
Vier verschiedene Plasmidkombinationen wurden gescreent, und diejenige mit dem höchsten Leuchtsignal wurde für weitere Experimente ausgewählt. Die EC50-Werte für jedes Beta-Arrestin-Isoform wurden anhand von Dosis-Wirkungs-Kurven ermittelt, die aus der maximalen Reaktion jeder Konzentration aus kinetischen Studien ermittelt wurden. Beim Entwerfen der PCR-Primer ist es wichtig, besonders aufzupassen.
Die Entwicklung der richtigen Konstrukte ist entscheidend für den Erfolg dieser Assays. Nach dieser Methode, Sie werden in der Lage sein, Rezeptor-Beta-Arrestin-Wechselwirkungen zu überwachen, sowie Rezeptor-Wechselwirkungen mit anderen zytosolischen Proteinen. Diese Methode wird helfen, grundlegende Fragen im Bereich der GPCR-Pharmakologie zu beantworten, indem untersucht wird, wie GPCR-Beta-Arrestin-Wechselwirkungen durch Modifikationen in der Ligandenstruktur moduliert werden können.
