Das hier beschriebene Protokoll stellt eine integrative Methode dar, die klassische mikrobiologische Assays mit Einzelzell-Live-Bildgebung kombiniert, um Escherichia coli Persisterzellen nach einer Behandlung mit hohem Ofloxacin-Gehalt zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, das Persistenzphänomen auf Populations- und Einzelzellebene zu analysieren. Die Kombination von Populations- und Einzelzellanalyse ermöglicht die molekulare und zelluläre Charakterisierung des Persistenzphänotyps.
Streifen Sie zunächst den interessierenden Bakterienstamm aus einem gefrorenen Glycerinvorrat auf eine LB-Agarplatte und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius für einen Zeitraum von 15 bis 19 Stunden, um einzelne Kolonien zu erhalten. Beimpfen Sie eine isolierte Kolonie in einem Glasröhrchen, das fünf Milliliter MOPS-Wachstumsmedium enthält, das mit 0,4 % Glukose angereichert ist, und fügen Sie dem Medium bei Bedarf ein selektives Antibiotikum hinzu. Legen Sie das Röhrchen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 180 U/min in einen Schüttelinkubator.
Zentrifugieren Sie am nächsten Tag einen Milliliter Kultur mit 2.300 g für drei Minuten, um die Zellen zu pelletieren, und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit dem gleichen PBS-Volumen. Messen Sie den OD bei 600 Nanometern und berechnen Sie das Volumen, das für einen anfänglichen OD600 von 0,01 in einem Endvolumen von zwei Millilitern benötigt wird. Als nächstes geben Sie zwei Milliliter MOPS-Glycerin 0,4%medium in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit transparentem Boden und beimpfen Sie mit dem berechneten Kulturvolumen über Nacht.
Legen Sie die 24-Well-Platte in einen automatisierten Mikroplatten-Reader, um den OD600 24 Stunden lang zu überwachen. Stellen Sie den Mikroplatten-Reader so ein, dass der OD600 alle 15 Minuten bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius und einer hohen Orbitalrotation von 140 U/min gemessen wird. Schmelzen Sie 100 Milliliter LB-Agar und lagern Sie den Kolben bei 55 Grad Celsius, um eine Erstarrung zu vermeiden.
Bereiten Sie sechs kleine Glaskolben vor und pipettieren Sie mit einer sterilen Pipette fünf Milliliter flüssiges LB-Agar-Agarmedium in jeden Kolben. Nehmen Sie 10 Mikroliter der fünf Milligramm pro Milliliter Loxacin-Stammlösung und verdünnen Sie sie in 90 Mikrolitern Reinstwasser. Geben Sie zunehmende Volumina des verdünnten Ofloxacins in jeden der sechs Glaskolben, die LB-Agar-Medium enthalten, um eine Endkonzentration von null bis 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Ofloxacin zu erhalten.
Mischen Sie die Lösung, indem Sie die Kolben mehrmals drehen, und gießen Sie das mit Antibiotika versetzte LB-Agar-Medium in eine Sechs-Well-Kulturplatte. Lassen Sie den Agar abkühlen, bis er fest ist, und trocknen Sie die Platte vor der Verwendung. Verdünnen Sie eine Bakterienkultur über Nacht auf eine endgültige Zelldichte von eins mal 10 bis siebte KBE pro Milliliter mit PBS.
Geben Sie zwei Mikroliter verdünnte Kultur auf jede Vertiefung der getrockneten Sechs-Well-Platte. Lassen Sie die Flecken trocknen, bevor Sie die Platte über Nacht in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius stellen. Prüfen Sie am nächsten Tag, bei welcher Ofloxacin-Konzentration das Wachstum von Bakterienkolonien gehemmt ist.
Gießen Sie ca. 25 Milliliter des vorbereiteten LB-Agars in eine Petrischale. Geben Sie dann fünf bis acht sterile Glasperlen auf jede erstarrte und getrocknete Platte. Drehen Sie die Platten um und beschriften Sie sie.
Als nächstes bereiten Sie zehnfache Glasröhrchen mit serieller Verdünnung vor, die 900 Mikroliter 0,01-molare Magnesiumsulfatlösung enthalten. Verdünnen Sie in einem Glasröhrchen eine Übernachtkultur in frischem und temperaturangepasstem Medium auf einen endgültigen OD600 von ca. 0,001 und lassen Sie die Kultur über Nacht in einem Inkubator wachsen. Am nächsten Tag, wenn der OD600 0,3 erreicht, übertragen Sie 100 Mikroliter der Kultur zur Verdünnung gemäß den Spot-Assay-Daten.
Führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der Bakterienkultur durch. Anschließend werden 100 Mikroliter der verdünnten Kultur auf die vorbereiteten LB-Agarplatten gelegt. Geben Sie die gewünschte Konzentration von Ofloxacin in die Bakterienkultur und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.
Entnehmen Sie zu relevanten Zeitpunkten 100 Mikroliter der Kultur und verdünnen Sie die Kultur entsprechend den Spot-Assay-Daten. 100 Mikroliter der verdünnten Kultur auf die LB-Agarplatten geben. Am nächsten Tag zählen Sie die Kolonien der über Nacht bebrüteten Platten bei den beiden höchsten Verdünnungen, für die Kolonien nachgewiesen werden können.
Berechnen Sie das Überlebensverhältnis, indem Sie die KBE pro Milliliter zu jedem Zeitpunkt an der KBE pro Milliliter bei T0 normalisieren, und stellen Sie den normalisierten Wert der logarithmischen Basis 10 als Funktion der Zeit dar. Entfernen Sie die Konservierungslösung aus jeder Vertiefung der mikrofluidischen Platte und ersetzen Sie sie durch frisches Nährmedium. Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte mit dem Verteilersystem, indem Sie auf die Schaltfläche Versiegeln oder über die mikrofluidische Software klicken.
Führen Sie als Nächstes auf der mikrofluidischen Softwareschnittstelle eine erste Priming-Sequenz durch, indem Sie auf Run Liquid Priming Sequence klicken. Inkubieren Sie die Platte in einem thermostatisch gesteuerten Schrank des Mikroskops bei 37 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden, bevor Sie mit der Mikroskopie-Bildgebung beginnen. Starten Sie dann eine zweite Run Liquid Priming-Sequenz, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte, indem Sie auf der mikrofluidischen Softwareschnittstelle auf Platte entsiegeln klicken. Ersetzen Sie das Medium in den Vertiefungen durch 200 Mikroliter frisches Medium, antibiotikahaltiges frisches Medium und 0,01 OD verdünnte Kulturprobe im frischen Medium. Nachdem Sie die mikrofluidische Platte wie zuvor gezeigt versiegelt haben, legen Sie die Platte auf das Mikroskopobjektiv im Mikroskopschrank.
Klicken Sie in der Mikrofluidik-Software auf Run Cell Loading Sequence, um das Laden der Zellen in die Mikrofluidikplatte zu ermöglichen. Stellen Sie mit dem Durchlichtmodus einen optimalen Fokus ein und wählen Sie mehrere Bereiche von Interesse aus, in denen eine angemessene Zellzahl von bis zu 300 Zellen pro Feld beobachtet werden kann. Bearbeiten Sie in der Mikrofluidik-Software die Option Benutzerdefinierte Sequenz ausführen, um die Injektion von frischem Medium mit 6,9 Kilopascal für sechs Stunden in die Vertiefungen eins und zwei zu programmieren, gefolgt von dem Medium mit dem Antibiotikum bei 6,9 Kilopascal oder sechs Stunden in Vertiefung drei und schließlich das frische Medium mit 6,9 Kilopascal für 24 Stunden in die Vertiefungen vier und fünf.
Führen Sie die Mikroskopie-Bildgebung im Zeitraffermodus mit einem Bild alle 15 Minuten mit Durchlicht und der Anregungslichtquelle für den Fluoreszenzreporter durch und starten Sie das mikrofluidische Programm. Öffnen Sie die ImageJ- oder Fiji-Software auf dem Computer und ziehen Sie die Hyperstack-Zeitraffer-Mikroskopiebilder in die Fidschi-Ladeleiste. Verwenden Sie "Bild", gefolgt von "Farbe" und dann "Zusammengesetzt" erstellen, um die verschiedenen Kanäle des Hyperstacks zu verschmelzen.
Verwenden Sie "Bild", "Farbe" und dann "Kanäle anordnen", wenn die Kanäle nicht der gewünschten Farbe entsprechen. Öffnen Sie das MicrobeJ-Plugin und erkennen Sie die Bakterienzellen mithilfe der manuellen Bearbeitungsoberfläche. Löschen Sie die automatisch erkannten Zellen, und umreißen Sie die gewünschten Persisterzellen manuell Bild für Bild.
Verwenden Sie nach der Erkennung das Ergebnissymbol in der manuellen Bearbeitungsoberfläche von MicrobeJ, um eine ResultJ-Tabelle zu generieren. Verwenden Sie die ResultJ-Tabelle, um Einblicke in verschiedene relevante Parameter der Einzelzellenanalyse zu erhalten, und speichern Sie die ResultJ-Datei. Der MHK von Ofloxacin wurde für beide Stämme mit 0,06 Mikrogramm pro Milliliter bestimmt, was darauf hindeutet, dass die hupA-mCherry-Fusion die Sensitivität von Ofloxacin im Vergleich zum isogenen Wildtyp-Stamm nicht beeinflusste.
Der Spot-Assay zeigte isolierte Klone bei geeigneten Verdünnungen über die Zeit, z. B. 10 bis zur negativen fünften Verdünnung zum Zeitpunkt Null. Im Time-Kill-Assay wurde eine typische biphasische Kurve beobachtet, bei der die erste Steigung die schnelle Abtötung der Nicht-Persister-Population widerspiegelt. Die zweite Phase zeigte eine langsamere Abtötungsrate, was das Vorhandensein von medikamententoleranten Persisterzellen zeigte.
Bemerkenswert ist, dass die Time-Kill-Kurve zeigt, dass das hupA-mCherry-Fusionsprotein keinen Einfluss auf die Time-Kill-Kinetik hatte. Im mikrofluidischen Experiment deutet die erste Wachstumsphase darauf hin, dass die Zellen vor der Behandlung mit Ofloxacin lebensfähig waren und sich teilten. Nach dieser ersten Wachstumsphase wurde die Zellteilung blockiert, sobald das Antibiotikum die Zellen erreichte.
Nach der Behandlung mit Ofloxacin, bei Perfusion mit frischem Medium, war die überwiegende Mehrheit der Zellen nicht in der Lage, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Im Gegensatz dazu könnte sich eine kleine Subpopulation verlängern und filamentöse Zellen bilden, die als Persisterzellen definiert werden. Das sich teilende Persisterfilament erzeugte mehrere Tochterzellen, von denen die meisten ähnlich wie unbehandelte Zellen zu wachsen und sich zu teilen begannen.
Die Zunahme der Zelllänge korrelierte mit einer Zunahme der gesamten mCherry-Fluoreszenzintensität, was einen Neustart der Replikation und eine Zunahme der Nukleoidhäufigkeit widerspiegelt. Bei der Verwendung eines Stammes, der einen intrazellulären Reporter enthält, um die Persistenz zu untersuchen, ist es im Vergleich zu einem Wildtyp-Stamm unerlässlich, dass die Anwesenheit des Reporters das Wachstum, die MHK und die Abtötung nicht beeinträchtigt. Das hier beschriebene Verfahren kann auf andere Erkrankungen und Bakterienarten angewendet werden, um zelluläre Reaktionen auf sich verändernde Umgebungen oder Stress zu überwachen.
Durch die Verwendung anderer fluoreszierender Reporter in einem identischen Aufbau können neue Einblicke in die Physiologie von Persisterzellen gewonnen werden.
