Der allgemeine Zweck dieser Methode ist es, die Wirkung der Stressbehandlung auf Bakterienzellen zu analysieren, sowohl an der Einzelzelle als auch auf der Populationsebene. Es bietet eine globale Vision der Auswirkungen von Stress auf mehrere Aspekte des bakteriellen Wachstums, einschließlich Zelllebensfähigkeit, Morphologie und DNA-Gehalt. Es ermöglicht auch die Charakterisierung der Bevölkerungserholung.
Diese Methode könnte in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, um die Aktivität neuer antimikrobieller Moleküle zu untersuchen und ihre Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit und das Wachstum von Bakterien zu schätzen. Eine stressinduzierende Behandlung hat eine Ineffizienz, wie Dosis und zeitabhängig. Es kann notwendig sein, Vortests durchzuführen, um die optimale Dosis und die Dauer der Behandlung zu bestimmen, bevor dieses Protokoll beginnt.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ermöglicht es, wichtige Details der einzelnen kritischen Schritte zu fotografieren und wie sie ordnungsgemäß ausgeführt werden. Zunächst impfen Sie fünf Milliliter MOPS EZ Rich Defined Medium mit einer einzigen Kolonie von E.Coli MG1655 HU-PAmCherry und wachsen bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 140 Umdrehungen pro Minute über Nacht. Am nächsten Morgen 100 Mikroliter der Probe extrahieren und mit 900 Mikrolitern Medium verdünnen, um die optische Dichte bei 600 Nanometern zu messen.
Verdünnen Sie dann die Kultur in einem Reagenzglas mit frischem Medium auf einen OD600-Nanometer von 0,01. Inkubieren Sie das geimpfte Reagenzglas bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 140 U/min, bis die optische Dichte 0,2 erreicht, was einer vollständigen Exponentialphase in reichhaltigem Medium entspricht. Dann aliquot die Kulturproben für Zeitraffermikroskopie-Bildgebung, die Verdünnung und Beschichtung Assay, die Durchflusszytometrie-Analyse, und die Mikroskopie-Snapshot-Bildgebung.
Setzen Sie die restlichen 4,4 Milliliter Zellkultur im Reagenzglas einer speziellen Stressbehandlung aus. Zum Beispiel 4,4 Mikroliter Cephalexin bei fünf Mikrogramm pro Milliliter und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 140 RPM. Bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen, bis zu 10 bis minus siebten, der 200 Mikroliter Kulturprobe in frischem Medium vor.
Mischen Sie zwischen jeder Verdünnung durch sehr sanfteWirbelung oder durch Invertieren des Rohres. Platte 100 Mikroliter der entsprechenden Verdünnung auf nicht ausgewählten LB-Agaroseplatten und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag zählen Sie die Anzahl der Kolonien, um die Konzentration lebensfähiger Zellen in jeder Kulturprobe zu bestimmen.
Plotten Sie die KBE pro Milliliter als Funktion der Zeit für die unbehandelten und behandelten Zellkulturen. Messen Sie die OD600 der Kultur auf einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Kulturprobe mit frischem Medium bei vier Grad Celsius, um eine Probe mit OD600 bei 0,06 zu erhalten, was etwa 15 000 Zellen pro Mikroliter entspricht.
Mischen Sie die verdünnte Bakterienprobe mit einer 10-Mikrogramm-Pro-Milliliter-Lösung des DNA-Fluoreszenzfarbstoffs bei der Volumenration von eins zu eins und inkubieren Sie im Dunkeln 15 Minuten. Mischen Sie die Probe vor der Injektion durch sehr sanftes Wirbeln oder durch Invertieren des Rohres. Übergeben Sie die Probe mit einer Durchflussrate von etwa 120.000 Zellen pro Minute in das Durchflusszytometer.
Erfassen Sie vorwärtsgestreutes und seitlich esstreudes Licht sowie DNA-Fluoreszenz-/Fluoreszenzsignal mit den entsprechenden Einstellungen. Zeichnen Sie das vorwärts gestreute Zelldichte-Histogramm, um die Verteilung der Zellgröße darzustellen, und zeichnen Sie das DNA-Fluoreszenzfarbstoff/fluoreszierendes Signalzelldichte-Histogramm, um den DNA-Gehalt in der Zellpopulation darzustellen. Zuerst heizen Sie die thermostatisierte Mikroskopkammer bei 37 Grad Celsius vor, um die Temperatur zu stabilisieren.
Bereiten Sie die in der Agarose montierten Dias vor, wie im Manuskript beschrieben. Platzieren Sie das Dia auf der Mikroskopbühne und führen Sie die Bildaufnahme mit Durchlicht mit einem Gesichtskontrastobjektiv und mit Lichtquellenanregung bei 560 Nanometern für mCherry durch. Wählen Sie Ansichtsfelder aus, die isolierte Zellen enthalten, um die automatisierte Zellerkennung während der Bildanalyse zu erleichtern.
Stellen Sie sicher, dass mindestens 300 Zellen abgebildet sind, um eine robuste statistische Analyse der Zellpopulation zu ermöglichen. Entfernen Sie zunächst die Konservierungslösung von der mikrofluidischen Platte und ersetzen Sie sie durch ein frisches Medium, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird, wie im Microfluidic Software User Guide beschrieben. Befestigen Sie die mikrofluidische Platte am Verteilersystem.
Und klicken Sie in der mikrofluidischen Software auf die Seal-Taste, um die Platte an das Verteilersystem zu versiegeln. Danach klicken Sie auf den Priming-Button. Positionieren Sie die mikrofluidische Platte mit dem Verteilersystem auf der Mikroskopstufe und heizen Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius vor, um die Erweiterung der mikrofluidischen Kammer zu vermeiden.
Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte am mikrofluidischen System, indem Sie auf die Schaltfläche Abdichten klicken. Ersetzen Sie das Medium von gut acht durch 150 Mikroliter Kulturprobe und ersetzen Sie das Medium von gut eins bis fünf durch das gewünschte Medium, mit oder ohne das spannungsinduzierende Reagenz. Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte und legen Sie sie auf die Mikroskopbühne.
Führen Sie in der mikrofluidischen Software das Zellladeverfahren aus. Prüfen Sie, ob die Belastung der Zellen zufriedenstellend ist, indem Sie im durchlässigen Licht unter das Mikroskop schauen. Konzentrieren Sie sich vorsichtig im Durchlichtmodus und wählen Sie mehrere Sichtfelder aus, die isolierte Bakterien zeigen und nicht überfüllt sind, etwa 10 bis 20 Zellen pro 100 Quadratmikroliter.
Klicken Sie in der mikrofluidischen Software auf die Schaltfläche "Benutzerdefinierte Sequenz ausführen" und programmieren Sie dann die Injektion des spannungsfördernden Mediums während 10 Minuten bei zwei PSI, gefolgt von einer Injektion bei einem PSI für die gewünschte Dauer der Stressbehandlung. Führen Sie die Mikroskopie im Zeitraffermodus alle 10 Minuten mit einem Frame durch, wobei Phasenkontrast bei Durchlicht und bei Bedarf eine 560 Nanometer Anregungslichtquelle für das mCherry-Signal verwendet werden. Starten Sie gleichzeitig die mikroskopische Bildaufnahme und das mikrofluidische Injektionsprotokoll.
Öffnen Sie die Fidschi-Software und das MicrobeJ-Plugin. Für die Snapshot-Analyse legen Sie alle Bilder, die einem Mikroskop entsprechen, in die MicrobeJ-Ladeleiste, um Bilder zu verketten und die erhaltene Bildstapeldatei zu speichern. Um Zeitrafferdaten zu erhalten, legen Sie einfach den Bildstapel in die Ladeleiste von MicrobeJ.
Führen Sie die automatisierte Detektion der Zellkonturen basierend auf der Segmentierung des Phasenkontrastbildes aus und führen Sie die Detektion der Nukleoide basierend auf der Segmentierung des gefärbten DNA-Fluoreszenzsignals aus. Überprüfen Sie die Genauigkeit der Zellerkennung visuell und verwenden Sie bei Bedarf das MicrobeJ-Bearbeitungswerkzeug zur Korrektur. Speichern Sie die erhaltene Ergebnisdatei.
Klicken Sie auf das Symbol ResultJ, um die Analyse abzuschließen und das ResultJ-Fenster zu erhalten. Es werden viele verschiedene Arten von Ausgabediagrammen generiert. Zeichnen Sie die normalisierten Histogramme der Zellform oder -länge und die mittlere Nukleoidzahl pro Zelle.
Diese Studie analysierte das Verhalten von Escherichia coli K-12-Zellen während der transienten Exposition gegenüber Cephalexin, einem Antibiotikum, das speziell die Zellteilung hemmt. Zellkulturen, die in Gegenwart von Cephalexin wuchsen, zeigten ähnliche OD600-Zuwächse wie die unbelasteten Kulturen. Die Konzentration lebensfähiger Zellen nahm nicht zu, wenn Cephalexin vorhanden war.
Die Zellen begannen sich wieder zu teilen, als Cephalexin entfernt wurde und erreichten schließlich nach zwei Stunden eine Konzentration, die der unbetonten Kultur entsprach. Unterschiedliche Spannungen führten zu einer unterschiedlichen Entkopplung der OD- und KBE-Pro-Milliliter-Kurven, je nach dem induzierten Effekt. Die Exposition gegenüber Cephalexin provozierte eine parallele Zunahme der Zellgröße und des DNA-Gehalts.
Als Cephalexin entfernt wurde, verringerten sich die Populationszellgröße und der DNA-Gehalt allmählich und ähnelten der unbelasteten Population nach zwei Stunden. Cephalexin provozierte die Bildung von langen Zellen mit normaler Zellbreite dann keine Teilung Septa. Quantitative Bildanalysen bestätigten den Anstieg der Zellgröße und des DNA-Gehalts.
Zeitrafferbilder bestätigen, dass Zelldehnung und Chromosomenreplikation und Segregation nicht durch die Exposition gegenüber Cephalexin gehemmt wurden. Die Analyse der filamentierten Zelllinie zeigte, dass die Zellteilung etwa 20 Minuten nach dem Abwaschen des Medikaments wieder aufgenommen wurde. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Bakterienpopulation in vollem exponentiellen Wachstum ist, bevor Stressbehandlungen induzieren.
Stressinduzierende Behandlung für diese Ansätze verwendet könnte gefährlich für experimentell sein, wie genotoxische Verbindung. Behandeln Sie also die Verbindung sorgfältig und tragen Sie Handschuh, Maske, Brille und Labormantel.
