Die Untersuchung von bioenergetischen Echtzeitprofilen von Oxphos und Glykolyse entwickelt sich zu einem Schlüsselfaktor bei der Charakterisierung der Gesundheit und Funktion von RPE. Die hochauflösende Respirometrie ermöglicht einen effizienten Vergleich des Stoffwechselstatus von normalem und erkranktem RPE. Diese Technik hat den Vorteil der gleichzeitigen Exploration von Oxphos und Glykolyse durch eine Messung der Sauerstoffverbrauchsrate, OCR und extrazellulären Versauerungsrate, ECAR.
RPE-Zellen sind hochmetabolisch aktive Zellen und gehören zu den ersten Zellen, die während der AMD degenerieren. Das Verständnis ihrer metabolischen und mitochondrialen Funktion ermöglicht die Entwicklung neuartiger Medikamente. Zu Beginn werden 100 Mikroliter pro Vertiefung der Zellsuspension im humanen RPE-Medium zu einer Endkonzentration von 20.000 Zellen pro 100 Mikroliter in jeder Vertiefung hinzugefügt.
Und achten Sie darauf, die vier Eckvertiefungen leer zu lassen. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten, und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette für Leichtigkeit und Konsistenz. Geben Sie nur 100 Mikroliter Medium zur Hintergrundkorrektur in die vier leeren Eckvertiefungen.
Lassen Sie die Zellkulturplatte eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen, um die Kanteneffekte zu minimieren. Anschließend mit 5% Kohlendioxid 37 Grad Celsius in den Inkubator geben und befeuchten. Untersuchen Sie die Zellen nach der Inkubation über Nacht unter dem Mikroskop, um ihre Morphologie und ihren Pigmentierungsgrad zu überprüfen, bevor Sie das Medium wechseln.
Achten Sie an den folgenden Untersuchungstagen darauf, dass die Zellen mit einer charakteristischen kopfsteinpflasterartigen Morphologie zusammenfließen und mit der Zeit eine Pigmentierung erwerben. Um die Hydratation der Sensorkartusche am Tag vor dem Assay sicherzustellen, füllen Sie jede Vertiefung der Utility-Platte mit 200 Mikrolitern deionisiertem Wasser und legen Sie die in Wasser getauchte Sensorkartusche auf die Utility-Platte. Bewahren Sie etwa 20 Milliliter der Kaliberlösung über Nacht in einem bei 37 Grad Celsius befeuchteten Ofen ohne Kohlendioxid auf.
Schalten Sie das hochauflösende Spirometriegerät ein und starten Sie die Software, damit sich das Gerät über Nacht bei 37 Grad Celsius stabilisieren kann. Ersetzen Sie am Tag des Assays mindestens 45 Minuten vor dem Ausführen des Assays das Wasser in der Versorgungsplatte durch ein gleiches Volumen erwärmter Kalibranzlösung. Erwärmen Sie 25 Milliliter des vorbereiteten Mito-Stresstest-Assay-Mediums ohne Phenolrot auf 37 Grad Celsius und vakuumfiltrieren Sie das pH-7,4-eingestellte Medium mit einer Tube-Top-Filtereinheit.
Entfernen Sie das humane RPE-Medium von der Zellkulturplatte und fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitetes Assay-Medium hinzu. Legen Sie dann die Zellkulturplatte für eine Stunde in einen bei 37 Grad Celsius befeuchteten Ofen ohne Kohlendioxid, bevor Sie mit dem Assay beginnen. Jede Sensorkartusche verfügt über vier Reagenzien-Abgabeöffnungen pro Vertiefung, um die Testverbindungen während des Assays in Zellkultur-Plattenvertiefungen zu injizieren.
Bereiten Sie jeweils drei Milliliter der Tenex-Arzneimittellösungen vor, indem Sie die Wirkstoffvorräte in den jeweiligen Assaymedien verdünnen. Als nächstes pipettieren Sie 20 Mikroliter des Tenex-Wirkstoffbestands in Anschluss A, 22 Mikroliter in Anschluss B und 25 Mikroliter in Anschluss C, um die angegebene endgültige Wirkstoffkonzentration in jeder Vertiefung zu erreichen. Öffnen Sie als Nächstes in der Analysesoftware die Registerkarte Vorlagen, wählen Sie Mito-Stresstest aus und füllen Sie die Gruppendefinitionen aus.
Geben Sie Details zur Injektionsstrategie für die Mito-Stresstestmedikamente ein. Geben Sie dann Details zu den verschiedenen Versuchsgruppen in den Assay ein, um sie zu kontrollieren oder zu behandeln. Eingabe von Details zu den Assay-Medien für die Zugabe verschiedener Ergänzungen und ihrer spezifischen Konzentrationen zu den Basis-Assay-Medien.
Fügen Sie schließlich den Zellentyp hinzu. Klicken Sie auf den nächsten Reiter und dann auf Plattenkarte, um verschiedene zu untersuchende Gruppen ihrer spezifischen Position auf der 96-Well-Platte zuzuordnen. Klicken Sie nach dem Ausfüllen der Plattenkarte auf die Registerkarte Protokoll, um das Geräteprotokoll für das standardmäßige Mito-Stresstestprotokoll zu überprüfen.
Klicken Sie dann auf Assay ausführen und setzen Sie die Sensorkartusche, die zur Kalibrierung in die Kaliberlösung getaucht ist, in die Versorgungsplatte ein. Dieser Vorgang dauert etwa 25 Minuten und jeder Biosensor wird unabhängig kalibriert, basierend auf der Sensorleistung, die in der Kaliberlösung mit bekanntem pH- und Sauerstoffgehalt gemessen wird. Entfernen Sie nach Abschluss der Kalibrierung die Nutzplatte und setzen Sie die Zellkulturplatte ein.
Nach der Basismessung injiziert das Gerät automatisch die Port A-Arzneimittellösung in jede Vertiefung, die drei Misch- und Messschleifen von jeweils drei Minuten folgt. Das gleiche Muster tritt nach jeder nachfolgenden Medikamenteninjektion in den anderen Ports auf. Entfernen Sie nach Abschluss des Laufs die Zellkulturplatte und die Sensorkartusche.
Stellen Sie zur Qualitätskontrolle sicher, dass alle Arzneimittelanschlüsse und die Sensorkartusche injiziert wurden, indem Sie die Anschlüsse auf keine Arzneimittelrückstände untersuchen. Als nächstes untersuchen Sie die Zellen in der Zellkultur-Mikrotiterplatte unter dem Mikroskop, um die konfluierende Monoschicht der Zellen sicherzustellen. Verwerfen Sie dann das Assay-Medium und ersetzen Sie es durch 60 Mikroliter eines x Lysepuffers in jeder Vertiefung.
Wickeln Sie die Ränder der Platte mit Parafilm ein, um eine Verdunstung zu verhindern, und legen Sie sie in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, um die Zelllyse über Nacht zu unterstützen, bevor Sie den Proteingehalt mit dem BCA-Assay quantifizieren. Normalisieren Sie pro Datenanalyse alle Daten, indem Sie die Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR und die extrazelluläre Ansäuerungsrate oder die ECAR-Werte durch die Mikrogramm Protein in jeder Vertiefung dividieren. Exportieren Sie dann den Mito-Stresstestberichtsgenerator, der Excel-Makros verwendet, um die Mito-Stresstestparameter mithilfe der Datenanalysesoftware automatisch zu berechnen.
Wenn die gleichen Schritte wie für den Mito-Stresstest befolgt werden, kann der glykolytische Stresstest durchgeführt werden, mit Ausnahme der Assay-Medienzusätze und der Arzneimittelinjektionen, die sich unterscheiden, wie in Tabelle eins und Tabelle zwei dargestellt. Das Gerät misst gleichzeitig OCR und ECAR für jeden Durchlauf. Für den Mito-Stresstest basieren die Perimeterberechnungen auf OCAR-Werten, während für den glykolytischen Stresstest die Parameterberechnungen auf ECAR-Werten basieren.
Hier ist eine OCR-Kurve, die durch die Durchführung des Mito-Stresstests an primären menschlichen RPE-Zellen generiert wurde. Die Berechnungen der Parameter des Mito-Stresstests werden als Balkendiagramme angezeigt. In ähnlicher Weise ist dies die ECAR-Kurve, die durch die Durchführung des glykolytischen Stresstests an primären menschlichen RPE-Zellen generiert wurde, und die Berechnungen werden als Balkendiagramme dargestellt.
Um die Port-B-Wirkstoffinjektion für den Mito-Stresstest zu optimieren, wurde die Wirksamkeit zweier Entkopplungsmittel bei der Erhöhung der OCR in primären humanen RPE-Zellen verglichen. Es wurde festgestellt, dass BAM15 FCCP bei der Verbesserung der mitochondrialen Atmungskapazität überlegen ist, was sich in der signifikant höheren maximalen Atmung und der Ersatzatmungskapazität von BAM15 im Vergleich zu FCCP zeigt. Es ist wichtig, daran zu denken, die Sensorkartusche am Tag vor der Durchführung des Assays zu hydratisieren.
Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die bioenergetischen Profile von RPE-Zellen besser zu charakterisieren und zu verstehen, wie RPE-Zellen als Reaktion auf verschiedene pathogene Reize metabolische Flexibilität zeigen.
