Dieses Protokoll ermöglicht die Echtzeitanalyse von zwei wichtigen bioenergetischen Signalwegen: mitochondriale Atmung und Glykolyse in frisch sezierten Ex-vivo-Netzhautgeweben von Mäusen. Die traditionelle Seepferdchenanalyse konzentrierte sich auf kultivierte monoschichtige Zellen, während dieses Protokoll es den Forschern ermöglicht, die mitochondriale Aktivität in frisch sezierten Geweben, insbesondere der Netzhaut, zu untersuchen. Diese Technik wird verwendet, um die Aktivitäten der Mitochondrien und Glykolyseflaggen in Netzhäuten von vererbten Netzhautdegenerations-Mausmodellen zu untersuchen.
Es ist ein nützliches Werkzeug für die Netzhautforschung und hat auch das Potenzial, auf andere Gewebearten angewendet zu werden, um mögliche Therapien zu entwickeln. Der schwierigste Teil dieses Protokolls besteht darin, hochwertige Stanzscheiben von frisch sezierter Mausnetzhaut zu erhalten, daher wird empfohlen, dass die Person, die diese Technik durchführt, über gute Netzhautdissektionsfähigkeiten verfügt. Öffnen Sie am Tag vor dem Experiment die Sensorkassettenkassette und geben Sie einen Milliliter Kalibriermedium in jede Vertiefung der Versorgungsplatte.
Über Nacht in einem kohlendioxidfreien Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Fluorophore zu aktivieren. Bereiten Sie am Tag des Experiments das Assay-Medium in verdünnten zusammengesetzten Arzneimitteln vom Lager vor. Erwärmen Sie das Assay-Medium im 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.
Richten Sie das Assay-Programm auf der Maschine ein, wie im Textmanuskript beschrieben. Öffnen Sie den Deckel der Kassette mit den Netzeinsätzen. Pipettieren Sie acht Mikroliter der Beschichtungsmischung auf jeden Netzeinsatz und verwenden Sie dann eine Pipettenspitze, um das Tröpfchen vorsichtig zu verteilen, um die Beschichtungsmischung gleichmäßig über den Netzeinsatz zu verteilen.
Schließen Sie die Kassette und lassen Sie die Netzeinsätze mindestens 25 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um sie zu absorbieren. Waschen Sie nach der Inkubation die Netzeinsätze, indem Sie vier Milliliter des Assay-Mediums direkt auf die Einsätze pipettieren. Schütteln Sie die Kassette vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Netzeinsätze mit dem Assay-Medium gewaschen werden.
Um den Netzhautstempel vorzubereiten, enukleieren Sie die Augen einer erwachsenen eingeschläferten Maus und legen Sie sie in eiskaltes PBS in eine Petrischale, dann legen Sie die Petrischale unter ein Seziermikroskop. Schneiden Sie mit Mikroscheren den Sehnerv ab und entfernen Sie dann vorsichtig die extrarektusfarbenen Muskeln, die außerhalb des Augapfels angebracht sind. Stanzen Sie mit einer 30-Gauge-Nadel ein Loch am Rand der Hornhaut.
Verwenden Sie dann feine Dissektionsmikrosoren, um einen kreisförmigen Schnitt entlang des Hornhautrandes zu machen. Entfernen Sie mit einer scharfen Dissektionszange die Hornhaut, die Linse und den Glaskörper aus der Augenmuschel. Machen Sie mehrere kleine Schnitte auf der Skleralschicht am Rand der Augenmuschel mit feinen Dissektionsmikrosen.
Verwenden Sie zwei scharfe Dissektionszangen, um das Sklerusgewebe auf jeder Seite festzuhalten, und ziehen Sie sehr vorsichtig an der Skleralschicht, um sie von der neuralen Netzhaut zu entfernen. Wiederholen Sie dies um die Augenmuschel, bis alle Sklera entfernt ist und eine intakte Netzhautschale erhalten wird. Machen Sie radiale Schnitte an der Netzhautschale, um sie abzuflachen, und erzeugen Sie mehrere verschiedene Abschnitte mit Dissektionsmikroschern.
Als nächstes schneiden Sie mit einem Biopsie-Puncher mit einem Durchmesser von einem Millimeter eine Netzhautscheibe aus jedem Abschnitt des abgeflachten Netzhautbechers. Schlagen Sie in gleichem Abstand vom Sehnervenkopf. Die vorbeschichteten Netzeinsätze mit einer Pinzette in die Dissektions-Petrischale überführen.
Legen Sie mit Hilfe von zwei superfeinen Wimpernbürsten die netzhautale Stanzscheibe in die Mitte des Netzeinsatzes, wobei die Ganglienzellschicht auf der Seite nach unten das Netz berührt und die Photorezeptorschicht nach oben zeigt. Um die Sensorkassette zu laden, nehmen Sie die Kassette mit hydratisierter Sensorkassette aus dem 37 Grad Celsius großen Inkubator. Nachdem Sie die Hydro-Booster-Abdeckung entfernt haben, legen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Versorgungsplatte.
Laden Sie das gewünschte Volumen an Injektionsmasselösungen in die entsprechenden Anschlüsse, indem Sie die Pipettenspitze in einem Winkel von 45 Grad halten und die Pipettenspitze auf halbem Weg in einen Injektionsanschluss mit der Fase der Spitze gegen die gegenüberliegende Wand des Injektionsanschlusses einführen. Laden Sie die Mischung vorsichtig in jeden Port. Legen Sie die Sensorkassette zur Kalibrierung in das Gerät ein, indem Sie auf die Schaltfläche Start ausführen klicken, um das Gerätefach zu öffnen.
Legen Sie die Sensorkassette in das Gerät ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Ich bin bereit, um die Kalibrierung zu starten. Laden Sie das gewünschte Volumen des Assay-Mediums in jede Vertiefung der Inselauffangplatte. Greifen Sie mit einer Pinzette den Rand des Netzeinsatzes mit den netztinalen Stanzscheiben und nehmen Sie ihn aus der Petrischale heraus.
Klopfen Sie leicht auf die Unterseite des Netzeinsatzes auf ein absorbierendes Wischtuch, um zusätzliche Flüssigkeit zu entfernen, und geben Sie sie in den Brunnen der Inselauffangplatte. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Netzeinsätze mit Netzhautstempeln in die Inselauffangplatte gelegt sind, die die Hintergrundkorrekturtöpfe und die leeren Vertiefungen mit leeren Netzeinsätzen füllt. Drücken Sie mit zwei Graefe-Pinzetten vorsichtig und vorsichtig auf den Rand jedes Netzeinsatzes und stellen Sie sicher, dass diese sicher an der Unterseite der Inselauffangplatte eingesetzt werden.
Legen Sie die beladene Inselauffangplatte fünf Minuten lang in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um sich aufzuwärmen, und werfen Sie dann die Versorgungsplatte nach Abschluss der Kalibrierung aus. Ersetzen Sie es durch die Inselauffangplatte, die Netzhautstempel enthält, und setzen Sie den Assay-Lauf fort, indem Sie auf die Schaltfläche Wägezellenplatte klicken. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, werfen Sie die Sensorkassette und die Inselerfassungsplatte mit Netzhautstempeln aus, indem Sie auf die Auswurftaste klicken, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Fertig, damit die Daten automatisch als ASYR-Datei gespeichert werden und der Bildschirm automatisch zur Ergebnisanzeige wechselt.
Der mitochondriale Stress-Assay, der einen OCR-Spuren- und Glykolytraten-Assay zeigt, der sowohl OCR- als auch ECAR-Spuren zeigt, wurde mit frisch sezierten retinalen Stanzscheiben von einem Millimeter durchgeführt. Im mitochondrialen Stresstest wurde Bam15 injiziert, um den Protonengradienten von der mitochondrialen ATP-Produktion zu entkoppeln, was zu einem Anstieg der OCR auf ein maximales Niveau führte. Rotenon und Antimycin A wurden injiziert, um die Atmung der Mitochondrien am ersten bzw. dritten Komplex zu hemmen, was zu einem Abfall der OCR auf das minimale Niveau führte.
Die Differenz zwischen dem maximalen OCR-Spiegel und der letzten Messung des basalen OCR-Spiegels spiegelt die mitochondriale Reservekapazität wider. Im glykolytischen Ratentest schaltet die Injektion von Rotenon und Antimycin A die mitochondriale Atmung ab und treibt die Glykolyse nach oben. Die Glykolyse wird durch Injektion von 2-Desoxy-d-Glucose ergriffen, die mit Glucose um die Hexokinase-Bindung konkurriert, wodurch das ECAR auf das minimale Niveau sinkt.
Die Differenz zwischen dem maximalen Glyko-ECAR-Gehalt im letzten Maß des Glyko-ECAR-Basalspiegels spiegelt die Glykolysereservekapazität wider. Um zuverlässige Daten zu erhalten, ist es wichtig, eine gute Qualität der netztinalen Stanzscheiben zu erhalten und die Gesamteinsektionszeit innerhalb von 1,5 Stunden zu begrenzen. Nach dem Experiment kann man die DNA des Proteingehalts einer Netzhautscheibe in einem Brunnen quantifizieren und daraus die Seepferdchendaten normalisieren.
Also wurde dieses Protokoll verwendet, um Entwicklung, Alterung und Krankheit in der Netzhaut zu untersuchen. Die Gewebepräferenz oder -abhängigkeit von verschiedenen Brennstoffsubstraten wie Glukose oder Fettsäuren wurde ebenfalls analysiert.
