Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Referenz für die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus dem Nil-Tilapia-Darm, um Einzelzellstudien in Aquakulturfischarten zu erleichtern. Die Technologie ist hocheffizient und kann unter den meisten Laborbedingungen eingesetzt werden. Es reduziert den Bedarf an zusätzlichen Versuchen zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Aquakulturfischarten.
Beginnen Sie damit, sechs Monate alte Nil-Tilapia-Fische 15 Minuten lang in gut belüftetem, sterilem Wasser abzuspülen, um lose gebundene Bakterien von der Oberfläche abzuwaschen. Zur Herstellung des enzymatischen Zelldissoziationsreagenzes wird die Kollagenase-Dispase in PBS auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnt. Mischen Sie 95 Volumenprozent der hergestellten enzymatischen Lösung und 5 Volumenprozent FBS.
Anschließend die Zentrifuge vor Gebrauch auf vier Grad Celsius vorkühlen. Legen Sie den eingeschläferten Fisch für die Gewebedissektion auf Eis und sammeln Sie drei bis vier Zentimeter des Darmmittelteils. Entfernen Sie das Fett und das Mesenterium mit einer Pinzette.
Entfernen Sie das Fett, das an der Darmoberfläche haftet, und die elastische und formbare klare Schleimhaut. Spülen Sie das Darmfragment vorsichtig mit sterilem, eiskaltem PBS mit einer Spritze ab, um den Darminhalt und den Schleim abzuwaschen. Zerlegen Sie das Fragment nach mehreren Wäschen in kleine Stücke und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter eiskaltem PBS.
Zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 x g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Und ersetzen Sie den Überstand durch einen Milliliter eiskaltes 0,08%BSA-DPBS. Mit einer Glaspipette vorsichtig absaugen, um die Gewebefragmente zu resuspendieren.
Nachdem Sie die Stücke noch einmal gewaschen haben, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter des vorbereiteten enzymatischen Dissoziationsreagenzes hinzu. Mischen Sie außerdem fünf Mikroliter RNA-Inhibitor mit dem Dissoziationsreagenz für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Stellen Sie das Röhrchen in ein temperiertes Wasserbad mit 37 Grad Celsius und drehen Sie das Röhrchen während der Inkubationszeit von 30 bis 60 Minuten alle fünf Minuten manuell um.
Sobald die Röhrchen gedreht sind, entfernen Sie das enzymatische Zelldissoziationsreagenz mit weit geöffneten Spitzen. Fügen Sie einen Milliliter eiskaltes 0,08%BSA-DPBS hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig auf und ab, um eine Zellzerstörung zu verhindern. Nach der Zentrifusion und dem erneuten Resuspendieren der Zellen wird das mit 0,08 % BSA-DPBS vorbenetzte 40-Mikrometer-Zellsieb auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben.
Führen Sie die Zellsuspension durch das Sieb. Klopfen Sie auf das Sieb, spülen Sie es dann mit 200 Mikrolitern DPBS aus und sammeln Sie die Suspension am Boden des Röhrchens. Nachdem Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt haben, fügen Sie fünf Mikroliter DNA hinzu und inkubieren Sie die Suspension 15 Minuten lang bei 15 bis 20 Grad Celsius.
Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 Mikrolitern eiskaltem DPBS ohne Kalzium- und Magnesiumionen. Pipettieren Sie dann vorsichtig mit weiten Spitzen auf und ab, um die Zellen zu mischen, und wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal. Zum Färben wird die Zellsuspension in 0,4%iger Trypanblaulösung in einem gleichen Verhältnis gemischt und drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Dann 10 Mikroliter der Mischung auf den Objektträger geben. Zählen Sie die lebensfähigen und toten Zellen unter dem Mikroskop in drei Feldern und berechnen Sie den Prozentsatz der Zellviabilität. Die Dissoziationseffizienzen mehrerer häufig verwendeter Enzyme wurden verglichen.
Es wurde nachgewiesen, dass die Kollagenase-Dispase-Mischung einen besseren Dissoziationseffekt hat als die Kollagenase-Dispase oder Trypsin allein und mehrere andere Enzymmischungen. Die mikroskopische Untersuchung zeigte, dass die Darmzellen eine hohe Lebensfähigkeit aufwiesen und sich als Einzelzellen verteilten. Die meisten Zellen waren lebensfähig, während einige wenige aufgrund der permeablisierten Zellmembran abgestorben waren.
Achten Sie auf die Art des verwendeten PBS. Die enzymatische Verdauungslösung kann nicht mit Calcium/Magnesium-freiem PBS verwendet werden, da das Enzym Calcium/Magnesium-Ionen benötigt, um effektiv zu funktionieren. Das Verfahren erleichtert Einzelzellstudien an Aquakulturfischarten und bietet eine wertvolle Referenz für die Entwicklung von Zelldissoziationsprotokollen von Aquakulturfischarten.
