Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte L-012-basierte Chemilumineszenzmethode zum Nachweis der ROS-Produktion in Echtzeit bei PAMP-Auslösung in Reisgeweben. Diese Methode ist einfach, standardisiert und unter fest kontrollierten Bedingungen hochgradig reproduzierbar. Dieses Verfahren wird von On Ying, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert.
Sterilisieren Sie zunächst die entspelzten Reissamen eine Minute lang mit 70% Ethanol und dann eine Stunde lang mit 40% Natriumhypochlorit. Spülen Sie die Samen fünfmal mit sterilem Wasser ab, um das restliche Chlor zu entfernen. Bei der Reisscheidenmethode werden die Samen direkt in das sterile Glasgefäß mit Murashige und Skoog oder MS-Medium gefüllt.
Um die Samen in der Blattscheibenmethode zu plattieren, plattieren Sie sie fünf bis sieben Tage lang auf MS-Platten und verpflanzen Sie sie dann in die Wachstumsmatrix oder den Boden. Züchten Sie die Sämlinge in einem Wachstumsraum mit einer Fotoperiode von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit. Schneiden Sie die Hülle von 10 Tage alten Reissämlingen einen Tag vor dem ROS-Test mit einer scharfen Rasierklinge oder einer chirurgischen Klinge zur Vorbehandlung in drei Millimeter große Segmente.
Legen Sie fünf Mantelsegmente für 10 bis 12 Stunden in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte, die 100 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser enthält. Schneiden Sie die Blattscheiben von vier bis sechs Wochen alten Reispflanzen mit einem Biopsiestempel mit einem Kolben ab. Schneiden Sie die Blattscheiben immer aus dem mittleren Drittel des zweiten Flügels der Hauptdeichsel ab, um die Datenvariation zu reduzieren.
Als nächstes legen Sie eine Blattscheibe für 10 bis 12 Stunden zur Vorbehandlung in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte, die 100 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser enthält. Halten Sie alle Blattscheiben schwimmend und nach oben gerichtet in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Wasservorbehandlung, um blattseitige Variationen zu vermeiden. Bereiten Sie die Auslöselösung vor, indem Sie 9,4 Milliliter 50 mikromolare Tris Hcl, 400 Mikroliter L012-Lösung, 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase und 100 Mikroliter Flg22 kombinieren.
Geben Sie 200 Mikroliter Auslöselösung in die Vertiefungen. Starten Sie die Software und klicken Sie auf die Schaltfläche Experimente, um ein neues Protokoll zu erstellen oder ein vorhandenes Protokoll zu verwenden. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Prozedur, um die Platte einzurichten, und wählen Sie die zu überwachenden Vertiefungen aus der Platte aus.
Klicken Sie auf Start kinetic und stellen Sie die Laufzeit auf 30 Minuten oder länger ein, abhängig von den experimentellen Anforderungen. Wählen Sie das minimale Intervall, um die Messwerte so oft wie möglich zu erhalten. Wählen Sie für die Integrationszeit je nach Signalintensität eine Sekunde oder länger.
Klicken Sie auf Validieren, gefolgt von Okay, um die Einstellungen zu bestätigen, klicken Sie dann im Popup auf Neue Platte erkennen und warten Sie, bis die Software das Dialogfeld für die Ladeplatte auffordert. Entfernen Sie vorsichtig das doppelt destillierte Wasser aus den Vertiefungen, die das vorbehandelte Gewebe enthalten, und vermeiden Sie Gewebeschäden oder Austrocknung. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 Mikroliter der Auslöselösung in die Vertiefungen zu geben, die das Gewebe enthalten.
Legen Sie die zu testende Platte auf den Träger und beginnen Sie mit der Erkennung. Um ROS durch Flg22 zu induzieren, wurden Blattscheiben und drei Millimeter lange Hüllen verwendet. Die ROS-Erzeugung wird 35 Minuten lang überwacht.
Die Balken zeigen die Mittelwerte der Standardabweichungen an, die aus fünf technischen Wiederholungen berechnet werden. Bei Reis wurde der Anstieg der ROS-Produktion erstmals in ein bis zwei Minuten festgestellt, erreichte seinen Höhepunkt nach 10 bis 12 Minuten und kehrte in etwa 30 bis 35 Minuten zum Ausgangswert zurück. Die Gesamtmenge der ROS wurde aus der Kurve berechnet.
Um die Gesamtmenge der ROS-Werte zu erhalten, wenden Sie die Formel auf die entsprechenden Datensätze an, um den ROS zu berechnen, der in jedem Zeitintervall generiert wird, der kombiniert werden kann, indem die Formelsumme angewendet wird, um den generierten Gesamtbetrag zu berechnen. Ein einzelnes Loch oder zwei Hälften einer Blattscheibe wurden in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben, die 10 bis 12 Stunden lang mit 100 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser vorbehandelt und dann mit Flg22 für die ROS-Induktion behandelt wurde. Die Messwerte der beiden Halbscheibenproben sind viel höher als die der gesamten Blattscheibe.
Im Durchschnitt sind die Gesamtwerte der beiden Halbscheibenproben fast 1,6-mal so hoch wie die der gesamten Blattscheibe, was proportional zur Kantenlänge und nicht zur Fläche der Proben ist. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass ROS hauptsächlich in Zellen an der Wundstelle erzeugt werden. Wenn Sie mit diesem Verfahren versuchen, arbeiten Sie vorsichtig mit Geweben und machen Sie keine zusätzlichen Ausschnitte, die eine Quelle für eine Datenvariation sein könnten.
Diese Methode kann auf alle anderen ROS-produzierenden physiologischen Prozesse in Pflanzengeweben angewendet werden.
