Dieses einfache und reproduzierbare Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um hochwertige Kerne aus gesunden und kranken Mausmodelllebern sowie Lebern aus menschlichen und nichtmenschlichen Primaten zu isolieren. Diese Methode benötigt nur eine geringe Menge an gefrorenem Gewebematerial. Außerdem ergibt die Dichteanreizung eine sehr saubere Kernsuspension, wobei alle wichtigen Zelltypen in der Leber in der endgültigen Kernvorbereitung erhalten bleiben.
Diese Methode der Kernextraktion kann in bioarchivierten menschlichen Leberproben verwendet werden, die in Biobanken gelagert werden. Beginnen Sie die Gewebehomogenisierung, indem Sie ein 2230 Milligramm oder fünf Millimeter großes Würfelstück aus einem Lebergewebe schneiden, das in der Petrischale auf Trockeneis mit einem vorgekühlten Skalpell platziert wird. Die Petrischale sofort auf Nasseis überführen und einen Milliliter Homogenisierungspuffer hinzufügen.
Zerkleinern Sie das Gewebe mit dem kalten Skalpell so weit wie möglich, damit es mit einer ein Milliliter breiten Öffnungsspitze aspirieren kann. Sammeln Sie die Gewebesuspension und geben Sie sie in einen vorgekühlten Zwei-Milliliter-Glas-Homogenisator. Waschen Sie die Petrischale mit zusätzlichen 0,521 Milliliter Homogenisierungspuffer und sammeln Sie alle verbleibenden Gewebestücke, während Sie alles auf Eis halten.
Führen Sie langsam und vorsichtig fünf Schläge mit losem Stößel A auf Eis aus, ohne Blasen zu erzeugen. Stellen Sie sicher, dass sich der Stößel bei jedem Schlag vorsichtig von oben nach unten des Homogenisators bewegt. Führen Sie anschließend 10 bis 15 langsame Schläge mit engem Stößel B auf Eis durch, ohne Blasen zu erzeugen.
Sobald Sie fertig sind, filtern Sie das Homogenat durch ein 50-Mikrometer-Zellsieb und geben Sie es in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie mehr als einen Filter oder Röhrchen für Homogenate, die einen hohen Anteil an Bindegewebsklumpen enthalten. Spülen Sie den Homogenisator und die Filter mit zusätzlichen 0,521 Milliliter Homogenisierungspuffer, um alle Gewebehomogenate vor der Zentrifugation des Dichtegradienten gründlich zu sammeln.
Für die Dichtegradientenzentrifugation zentrifugieren Sie das gefilterte Homogenat in einer vorgekühlten Festwinkelzentrifuge bei 1000 G acht Minuten lang bei vier Grad Celsius. Während die Probe zentrifugiert wird, bereiten Sie ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 250 Mikrolitern 50%iger Jodixanol-Verdünnung und ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit 500 Mikrolitern 29%iger Jodixanol-Verdünnung vor. Beide Röhrchen auf Eis legen.
Dann aus der Zentrifugensuspension den Überstand absaugen, ohne das Pellet mit einer Vakuumpumpe zu stören. Suspendieren Sie das Pellet in 250 Mikroliter Homogenisierungspuffer mit der ein Milliliter breiten Pipettenspitze. Dann werden 250 Mikroliter der Kernsuspension in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 250 Mikrolitern 50% Jodixanol überführt und vorsichtig und gründlich gemischt, um eine 25%ige Jodixanol-Kernsuspension zu erzeugen.
Als nächstes werden 500 Mikroliter der 25%igen Jodixanolkernsuspension in ein vorgekühltes Röhrchen-Milliliterrohr überführt, das 500 Mikroliter 29%iger Jodixanol-Verdünnung enthält. Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer vorgekühlten Schaufelzentrifuge bei 12, 500 G für 20 Minuten, wobei die Pause ausgeschaltet ist. Kurz bevor der Zentrifugationsschritt abgeschlossen ist, fügen Sie die RNAs-Inhibitoren zum Kernspeicherpuffer oder NSB hinzu, während Sie zu den Einzelkern-RNA-Sequenzierungspipelines fortfahren.
Nach Abschluss der Zentrifugation saugen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe ab, ohne das Pellet zu stören. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 100 bis 300 Mikrolitern NSB mit der ein Milliliter breiten Pipimpelspitze und geben Sie die Kernsuspension in ein sauberes, vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die Kerne mit Trypanblau-Lösung mit einem manuellen Hämozytometer und verwenden Sie sofort die erhaltene Kernsuspension für den Einzelkern-Genomik-Assay.
Für die durchflusszytometrische Zellsortierung filtrieren Sie die Kernsuspension durch einen 50-Mikrometer-Filter in eine vorgekühlte Fünf-Milliliter-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder Faxröhre. Verwenden Sie einen Durchflusszytometrie-Sortierer, der mit einer 100-Mikrometer-Düse ausgestattet ist, und legen Sie die Faxröhre auf den Sortierer, bevor Sie eine Vorschau der Probe anzeigen. Richten Sie die Gating-Strategie für die Kernsortierung ein, beginnend mit einem Streutor, indem Sie den Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Seitenstreubereich darstellen, gefolgt von Hoaxed Höhe versus Hoaxed Area und dann Hoaxed Breite versus Hoaxed Area.
Visualisieren Sie das Ploidieprofil der Kerne im Hoaxed-Area-Histogramm. Für die Sortierung in 96 oder 384 Well-Platten stellen Sie die Tröpfchenverzögerung ein und optimieren Sie die Plattenausrichtung mit der farbmetrischen Methode. Stellen Sie die Probenkühlung und den Plattenhalter auf vier Grad Celsius ein, wobei die Probenrotation bei 300 U/min eingeschaltet ist.
Sortieren Sie die einzelnen Kerne bei einer Probenkonzentration von etwa einem mal 10 bis zum fünften Kern pro Milliliter mit einer Flussrate von 200 bis 500 Ereignissen pro Sekunde. Die mikroskopische Untersuchung der aus gefrorenen Lebern extrahierten Kerne zeigte, dass der Schritt der Zentrifugation des Dichtegradienten die Entfernung unerwünschter Zell- und Gewebetrümmer erheblich erleichterte. Diese Methodik bewahrte alle Ebenen der Ploidie, die durch zytometrische Analyse validiert und quantifiziert wurde.
Aus den Daten, die durch Kernextraktion gewonnen wurden, wurden qualitativ hochwertige Metriken beobachtet. Einheitliche mannigfaltige Approximation und Projektion repräsentierte die Anzahl der Zählungen über alle Kerne und die Hauptzelltypen, die sicher nur mit dem Kerntranskriptom und der relativ flachen Sequenzierung identifiziert werden können. Dieser Ansatz ermöglichte die Untersuchung leberspezifischer Transkriptionsfaktoren und nachgeschalteter Zielgene, die am Metabolismus von Xenobiotika beteiligt sind.
Das komplementäre Muster von charakteristischen Genen wie dem perzentralen CYP2E1 und dem periportalen CYP2F2 zeigte, dass die extrahierten Kerne wichtige Informationen über die Leberspende behielten. Die Genexpressionsbibliothek von RNA wurde bis zu einer Tiefe von 44.600 Lesevorgängen pro Kern und die ATAC-Bibliothek bis zu einer Tiefe von 43.500 Lesevorgängen pro Kern sequenziert. Eine gewichtete Nearest-Neighbor-Analyse, die für mehrere Messungen beider Modalitäten, RNA plus ATAC, unter Verwendung der Pakete Seurat und Signac durchgeführt wurde, ermöglichte die Identifizierung und Annotation der Haupt- und Nebenleberzelltypen ohne prominente Verzerrungen aufgrund von Zellgröße oder nuklearer Fragilität.
Auch die vorgeschalteten Transkriptionsregulatoren und die charakteristischen Gene der Leberspende wurden bei dieser Methode nachgewiesen. Es ist wichtig, zu vermeiden, dass während der Homogenisierung der Daunen zu viele Blasen entstehen, wenn die Stößel nach oben und unten bewegt werden, und sich an die im Protokoll angegebene Anzahl von Schlägen zu halten.
