Die Untersuchung der Gewöhnung auf der Ebene einer einzelnen Zelle wird dazu beitragen, Lernparadigmen zu charakterisieren, die unabhängig von komplexen neuronalen Schaltkreisen sind, und uns so helfen, die Ursprünge der Intelligenz zu verstehen. Diese Technik ermöglicht es, die Kraft und Frequenz der mechanischen Stimulation, die an Zellen abgegeben wird, unter automatischer Computersteuerung zu variieren, wodurch die Vielfalt der Eingabesequenzen stark erhöht wird. Die Verwendung dieser Methoden zur Untersuchung der zellulären Gewöhnung wird uns helfen, mehr über Erkrankungen wie ADHS und Tourette-Syndrom zu erfahren, bei denen die Gewöhnung beeinträchtigt ist.
Schließen Sie zunächst den Motortreiber an den Motor an, indem Sie die beiden Drähte mit der Bezeichnung A von der Treiberplatine mit den blauen und roten Drähten am Motor verbinden. Verbinden Sie dann die beiden Drähte mit der Bezeichnung B von der Treiberplatine mit den grünen und schwarzen Drähten am Motor. Nachdem Sie die Steckplatinenschaltung mit besonderer Sorgfalt aufgebaut haben, um die LEDs in der richtigen Polarität zu verbinden, verbinden Sie die VCC von der Treiberplatine mit der oberen Schiene der weißen Steckplatine.
Und der Boden vom Fahrerbrett bis zur unteren Schiene des Steckbretts. Als nächstes verbinden Sie die Masse der Steckplatine mit dem Erdungsstift der Mikrocontrollerplatine. Verbinden Sie dann die grüne LED, die rote LED, die Schalter- und Knopfdrähte mit den digitalen Pins 8, 9, 10 und 11 der Mikrocontrollerplatine.
Verbinden Sie die digitalen Pins des Mikrocontroller-Boards zwei und drei mit den Treiberplatinendrähten, Schritt und Richtung. Verbinden Sie dann Pin vier mit MS1, Pin fünf mit MS2, PIN sechs mit MS3 und Pin sieben mit Enable. Um die Treiberplatine mit Strom zu versorgen, stecken Sie die 12-Volt-Versorgung in den schwarzgrünen Adapterstecker, der über zwei rote Drähte mit der Motortreiberplatine verbunden ist.
Laden Sie das Steuerungsprogramm auf die Mikrocontroller-Platine herunter. Verwenden Sie ein USB-Kabel, um die Mikrocontrollerplatine an einen Computer anzuschließen, der auch als Stromquelle für die Mikrocontrollerplatine dient. Nachdem Sie Stentor erhalten haben, beschichten Sie eine 35-Millimeter-Platte, indem Sie drei Milliliter der 0,01% igen Polyornithinlösung auf die Platte geben und über Nacht stehen lassen.
Waschen Sie den Teller zweimal mit Reinstwasser und einmal mit pasteurisiertem Quellwasser. Dann geben Sie 3,5 Milliliter pasteurisiertes Quellwasser auf die 35-Millimeter-Platte. Fügen Sie drei Milliliter pasteurisiertes Quellwasser in den ersten Brunnen und fünf Milliliter in den zweiten und dritten Brunnen hinzu.
Fügen Sie mit einer P1000-Pipette zwei Milliliter Stentor aus einer Kulturschale in die erste Vertiefung der sechs Well-Platten hinzu. Identifizieren Sie einzelne Stentor mit einem Stereomikroskop und verwenden Sie dann eine P20-Pipette, um 100 Stentor von der ersten Vertiefung in die zweite Vertiefung zu übertragen. In ähnlicher Weise werden nach der Identifizierung einzelner Stentor mit einem Stereomikroskop, wie zuvor gezeigt, 100 Stentor mit einer P20-Pipette von der zweiten Vertiefung in die dritte Vertiefung übertragen.
Dann mit einer P200-Pipette 100 Stentor in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern aus der dritten Vertiefung der sechs Vertiefungsplatten in die 35-Millimeter-Platte übertragen, so dass das Endvolumen vier Milliliter beträgt. Kleben Sie ein Stück weißes Papier auf das Metalllineal der Gewöhnungsvorrichtung, um sicherzustellen, dass der linke Rand des Papiers zwei Zentimeter vom Ende des Lineals entfernt ist, das dem Anker am nächsten ist. Kleben Sie die Unterseite der 35-Millimeter-Platte mit doppelseitigem Klebeband in die Mitte des zwei mal zwei Zoll großen Papiers auf das Lineal der Gewöhnungsvorrichtung.
Lassen Sie die 35-Millimeter-Platte mindestens zwei Stunden bei geschlossenem Deckel auf dem Gewöhnungsgerät. Zentrieren Sie die USB-Mikroskopkamera direkt über der 35-Millimeter-Platte von Stentor. Um die Webcam-Recorder-Anwendung zu installieren, öffnen Sie die Webcam-Recorder-App und wählen Sie das USB-Mikroskop aus dem Dropdown-Menü aus.
Stellen Sie den Fokus der USB-Mikroskopkamera so ein, dass die Zellen klar sichtbar sind, und die Kameraposition, um die Anzahl der Zellen im Sichtfeld zu maximieren. Nach dem Öffnen des seriellen Monitors der Mikrocontroller-Platine wählen Sie "no line ending" und stellen Sie es auf 9.600 Baud ein. Verwenden Sie den L-Befehl im Mikrocontroller-Board-Programm, um den Anker abzusenken, bis er das Lineal kaum berührt, und den R-Befehl, um den Arm bei Bedarf anzuheben, um die genaue Position einzustellen.
Verwenden Sie den Befehl I, um den automatischen Modus auf dem Gewöhnungsgerät zu initialisieren. Geben Sie die Schrittgröße und Zeit zwischen den Impulsen in Minuten in der Befehlszeile ein. Starten Sie die Aufnahme eines Videos mit der Webcam-Recorder-App, indem Sie die rote Aufnahmetaste drücken.
Dann legen Sie den Schalter am Gewöhnungsgerät um, um das Experiment mit der ersten automatisierten mechanischen Impulsabgabe zu beginnen. Unmittelbar bevor der erste mechanische Impuls auf dem Video erscheint, halten Sie inne und zählen Sie die Anzahl der Stentor, die beide an der Unterseite der 35-Millimeter-Platte verankert und in einer länglichen trompetenartigen Form verlängert sind. In ähnlicher Weise zählen Sie nach dem ersten Impuls die Anzahl der Stentor, die sowohl am Boden der Platte verankert als auch in eine kugelförmige Form zusammengezogen sind.
Teilen Sie die zweite Zählung durch die erste Zählung, um den Anteil von Stentor zu bestimmen, der sich als Reaktion auf den mechanischen Reiz zusammengezogen hat, während Sie den Vorgang für alle mechanischen Impulse im Experiment wiederholen. Die Kontraktionswahrscheinlichkeit des Stentor wurde überwacht und die Ergebnisse zeigten, dass er im Laufe einer Stunde progressiv abnimmt. Nach dem Empfang von mechanischen Impulsen der Stufe vier mit einer Frequenz von einem Klopfen pro Minute, was auf eine Gewöhnung hinweist.
Die Änderung der Kraft oder Frequenz der mechanischen Impulsabgabe kann die Gewöhnungsdynamik von Stentor verändern. Bei Verwendung des Impulsfrequenzsatzes der Stufe zwei von einem Tap pro Minute wird eine Gewöhnung im Laufe einer Stunde ausgeschlossen. Wir können verschiedene Arten von Gewöhnungsdynamiken untersuchen, indem wir die Kraft und Frequenz der mechanischen Stimulation verändern.
Dies ist eine Gelegenheit, verschiedene Arten des Lernens zu erforschen, wie z.B. Sensibilisierung. Quantitative Erkenntnisse über das Lernen von Einzelzellen, die aus unseren Methoden gewonnen wurden, könnten andere Wege zur Reprogrammierung von Zellen in mehrzelligen Geweben inspirieren. Ein weiterer möglicher Weg, um Krankheiten zu bekämpfen.
