단일 세포 수준에서 습관화를 연구하면 복잡한 신경 회로와 독립적 인 학습 패러다임을 특성화하여 지능의 기원을 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 자동 컴퓨터 제어하에 세포에 전달되는 기계적 자극의 힘과 주파수를 변화시켜 입력 시퀀스의 다양성을 크게 증가시킵니다. 이러한 방법을 사용하여 세포 습관화를 연구하면 습관화가 손상된 ADHD 및 투렛 증후군과 같은 상태에 대해 더 많이 배울 수 있습니다.
시작하려면 드라이버 보드에서 A라고 표시된 두 개의 와이어를 모터의 파란색 및 빨간색 와이어에 연결하여 모터 드라이버를 모터에 연결합니다. 그런 다음 드라이버 보드에서 B라고 표시된 두 개의 와이어를 모터의 녹색 및 검은색 와이어에 연결합니다. LED를 올바른 극성으로 연결하기 위해 특별히 주의하여 브레드 기판 회로를 구축한 후 드라이버 보드의 VCC를 흰색 브레드 기판의 상단 레일에 연결합니다.
그리고 드라이버 보드에서 브레드 보드의 하단 레일까지의 접지. 그런 다음 브레드 기판의 접지를 마이크로 컨트롤러 기판의 접지 핀에 연결합니다. 그런 다음 녹색 LED, 빨간색 LED, 스위치 및 버튼 와이어를 각각 마이크로 컨트롤러 보드 디지털 핀 8, 9, 10 및 11에 연결합니다.
마이크로 컨트롤러 보드 디지털 핀 2와 3을 드라이버 보드 와이어, 스텝 및 방향에 연결합니다. 그런 다음 핀 4를 MS1에, 핀 5를 MS2에, 핀 6을 MS3에, 핀 7을 연결하여 활성화합니다. 드라이버 보드에 전원을 공급하려면 12V 공급 장치를 두 개의 빨간색 와이어로 모터 드라이버 보드에 연결된 검은색 녹색 어댑터 플러그에 꽂습니다.
제어 프로그램을 마이크로 컨트롤러 보드에 다운로드합니다. USB 케이블을 사용하여 마이크로 컨트롤러 보드를 컴퓨터에 연결하면 마이크로 컨트롤러 보드의 전원으로도 사용됩니다. 스텐터를 얻은 후, 0.01% 폴리오르니틴 용액 3밀리리터를 플레이트에 첨가하여 35밀리미터 플레이트를 코팅하고 밤새 방치한다.
초순수로 접시를 두 번, 저온 살균 된 샘물로 한 번 씻으십시오. 그런 다음 3.5 밀리미터의 저온 살균 된 샘물을 35 밀리미터 판에 첨가하십시오. 첫 번째 우물에 저온 살균 된 샘물 3 밀리리터를 추가하고 두 번째 및 세 번째 우물에 5 밀리리터를 추가하십시오.
P1000 피펫을 사용하여 배양 접시에서 6 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 2 밀리리터의 스텐터를 추가합니다. 실체 현미경으로 개별 스텐터를 식별한 다음 P20 피펫을 사용하여 첫 번째 웰에서 두 번째 웰로 스텐터 100개를 옮깁니다. 유사하게, 이전에 시연된 대로 실체 현미경으로 개별 스텐터를 식별한 후 P20 피펫을 사용하여 두 번째 웰에서 세 번째 웰로 100 스텐터를 옮깁니다.
그런 다음 P200 피펫을 사용하여 총 부피가 500 마이크로 리터의 100 스텐터를 6 웰 플레이트의 세 번째 웰에서 최종 부피가 4 밀리리터가되도록 35 밀리미터 플레이트로 옮깁니다. 습관화 장치의 금속 눈금자에 흰 종이를 테이프로 붙이고 종이의 왼쪽 가장자리가 뼈대에 가장 가까운 눈금자 끝에서 2cm 떨어져 있는지 확인합니다. 양면 테이프를 사용하여 35mm 플레이트의 바닥을 습관화 장치의 자 위에 있는 2 x 2인치 용지의 중앙에 부착합니다.
뚜껑을 닫은 상태에서 습관화 장치에 35mm 플레이트를 최소 2 시간 동안 그대로 두십시오. USB 현미경 카메라를 스텐터의 35mm 플레이트 바로 위에 놓습니다. 웹캠 레코더 응용 프로그램을 설치하려면 웹캠 레코더 앱을 열고 드롭다운 메뉴에서 USB 현미경을 선택합니다.
USB 현미경 카메라의 초점을 조정하여 셀이 명확하게 보이도록 하고 카메라 위치를 조정하여 시야의 셀 수를 최대화합니다. 마이크로 컨트롤러 보드 직렬 모니터를 연 후 라인 엔딩 없음을 선택하십시오"그리고 9, 600 보드로 설정하십시오. 마이크로 컨트롤러 보드 프로그램에서 L 명령을 사용하여 눈금자에 거의 닿지 않을 때까지 전기자를 내리고 R 명령을 사용하여 정확한 위치를 조정하기 위해 필요한 경우 암을 올립니다.
I 명령을 사용하여 습관화 장치에서 자동 모드를 초기화합니다. 명령줄에 펄스 사이의 단계 크기와 시간(분)을 입력합니다. 빨간색 녹화 버튼을 눌러 웹캠 레코더 앱을 사용하여 비디오 촬영을 시작합니다.
그런 다음 습관화 장치의 스위치를 뒤집어 첫 번째 자동 기계식 펄스 전달로 실험을 시작합니다. 비디오에 첫 번째 기계식 펄스가 나타나기 직전에 일시 중지하고 35mm 플레이트의 바닥에 고정되고 길쭉한 트럼펫 모양으로 확장 된 스텐터의 수를 세십시오. 유사하게, 첫 번째 펄스 후, 플레이트의 바닥에 고정되고 공 모양으로 수축 된 스텐터의 수를 세십시오.
두 번째 카운트를 첫 번째 카운트로 나누어 실험의 모든 기계적 펄스에 대해 절차를 반복하면서 기계적 자극에 반응하여 수축한 스텐터의 비율을 결정합니다. 스텐터의 수축 확률을 모니터링한 결과 1시간 동안 점진적으로 감소하는 것으로 나타났습니다. 레벨 4 기계적 펄스를 분당 1 회 탭하여 습관을 나타냅니다.
기계적 펄스 전달의 힘이나 주파수를 변경하면 스텐터 습관화 역학이 바뀔 수 있습니다. 분당 1 회 탭의 레벨 2 펄스 세트 주파수를 사용하는 동안 1 시간 동안 습관화를 배제합니다. 우리는 기계적 자극의 힘과 빈도를 변경하여 다양한 유형의 습관화 역학을 연구 할 수 있습니다.
이것은 민감화와 같은 다양한 유형의 학습을 탐구 할 수있는 기회입니다. 우리의 방법에서 수집 한 단일 세포 학습에 대한 정량적 통찰력은 다세포 조직 내에서 세포를 재 프로그래밍하기위한 다른 방법에 영감을 줄 수 있습니다. 질병과 싸울 수있는 또 다른 잠재적 인 방법.
