Diese Arbeit wurde von NIH Grant R01 GM113602 (WFM) und NSF 1144247 (AL) unterstützt. Wir erkennen, Mark Slabodnick und Natalie Kirkland für die Entwicklung von der ersten Versionen von einigen dieser Protokolle und für informative Gespräche. Wir danken Karina Perlaza und Greyson Lewis für kritische Lektüre des Manuskripts.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Kultivierung von Stentor präsentiert eine Reihe von Herausforderungen. Erstens, um Experimente durchzuführen, die eine große Anzahl von Zellen erfordern, braucht man weiterhin eine große Anzahl von Stentor Kulturen, wie Kulturen werden ungesund, wenn Stentor Konzentration 20 Zellen/mL übersteigt. Zweitens die Organismen, die Stentor Kulturen oft kontaminieren können schneller als Stentor teilen und überwältigen die Kultur (eine gemeinsame Verunreinigung ist Rädertierchen). Daher ist es notwendig, die Kultur unter dem Mikroskop in regelmäßigen Abständen zu überprüfen und die Verunreinigungen zu entfernen. Gelegentlich muss eine neue Kultur von einer kleinen Anzahl von Zellen manuell aus einem kontaminierten Kultur gerettet gestartet werden. Dadurch erhöht sich den Zeitaufwand für gesunde Stentor Kulturen pflegen. Drittens erfordert die Expansion einer einzelnen Zelle in eine 400 mL-Kultur mindestens einen Monat, weil Stentor Zellzyklus 3-5 Tage. Viertens: im Gegensatz zu anderen Modell Ciliaten, Stentor selten eingehen Zyste Form und sie können nicht eingefroren werden.
Ein wichtiger Aspekt der Kultivierung von Stentor ist die Auswahl eines geeigneten Nahrungsmittel Organismus. Verschiedene Methoden zur Kultivierung von Stentor wurden bisher beschrieben. Einer von ihnen schlägt, Magermilch, Kultur Bakterien verwenden, die dann Stentorfüttern. Diese Technik ist wirksam bei der Kultivierung von Stentor; Anwendung der genomischen Techniken erfordert jedoch reine Proben um Verwechslungen aus genomischer liest aus undefinierten Essen Organismen. Über das aktuelle Protokoll, Stentor in Masse angebaut werden können und weil ihre Nahrung, Chlamydomonas, sequenziert wurde, das Vorhandensein von genomischen Kontamination von Lebensmitteln Organismus erkannt und für gesteuert werden kann. Aus unbekannten Gründen musste Zahnstein ergänzen seine Vorräte durch Rücksendung, wo er Stentor vor gefunden. Mit dem aktuellen Protokoll konnten wir Stentor für Jahre zu halten.
Regeneration-Experimente mit Stentor sind im Allgemeinen einfach, aber es gibt ein paar wichtige Details im Auge zu behalten. In Bezug auf Abschnitt 2 Schneiden Stentor Zellen in zwei Hälften in Minuten gemeistert werden können. Mastering erweiterte Mikrochirurgie-Verfahren von Stentor erfordern eine Woche Praxis. Während Durchführung einer Saccharose oder Harnstoff-Behandlung (Abschnitt 3), wenn zu Beginn der Bildgebung die meisten Zellen noch ihre Membranellar Bands haben, erhöhen Inkubationszeit von 10-30 s für als Saccharose Behandlung als nächstes ausgeführt wird. Erhöhen Sie die Zeit der Saccharose Behandlung über 3 min Inkubation nicht, weil es in Zelltod führen wird.
Imaging von Stentor muss Regeneration Methoden große Zellen über lange Zeiträume hinweg. Das bildgebende Verfahren, die in Abschnitt 4 beschriebenen kann nur mit einem aufrechten Mikroskop verwendet werden. Wenn einem inversen Mikroskop stattdessen verfügbar ist, können Zellen auf eine Folie oder ein Deckglas in kleinen Kammern platziert werden. Eine Methode ist die Schaffung eine Kammer aus Vaseline und Abdeckung mit einem anderen deckgläschen um Verdunstung zu verhindern. Alternativ kann eine Kammer für eine einzelne Zelle durch ein Loch mit einem Locher der gewünschten Größe in einem 1 x 1 cm-2 Quadratmeter Silizium Spacer gemacht werden (Tabelle der Materialien), Platzierung des Abstandhalters auf einem deckgläschen, indem Zellen in der Kammer , und die Kammer mit einem anderen Deckglas abdecken. Beim abbilden, wenn Stentor nicht in der richtigen Ausrichtung, die charakteristischen Merkmale der einzelnen Phasen der Regeneration zu beobachten sind, tippen Sie auf die Platte fest um den Handy-Vertrag zu machen. Sehen Sie sich die Zelle erweitert werden, um die Phase der Regeneration zu identifizieren (Vollauszug dauert etwa 45 s). Wenn die Zelle immer noch in der falschen Ausrichtung ist, wiederholen Sie das klopfen. Die in Abbildung 1 und Abbildung 6 gezeigten Bilder wurden von einem Stereo-Zoom-Mikroskop aufgenommen; jedoch können alle Experimente, die detailliert mit einer 5 X Stereo-Mikroskop sezieren durchgeführt werden.
Eine weitere Herausforderung neben Kultivierung und imaging- Stentor ist das Tracking der Regeneration, insbesondere die Höhe der Zeit notwendig, um Phasen identifizieren. Wenn die regenerierenden Zellen perfekt ausgerichtet mit der Region der mündlichen Primordium deutlich sichtbar ist, dauert Identifikation der Stufe wenige Sekunden. Manchmal ist jedoch die Stentor -Zelle in eine Orientierung verhindern klare Zuweisung der Regeneration Stufe, damit mehr Zeit nehmen, zu identifizieren. Die erhebliche Menge an Zeit benötigt, um Bühne einzelne regenerierende Zellen, die Quantifizierung aller regenerierenden Zellen verzögern, damit Verringerung der zeitlichen Präzisions Inszenierung und erfordern den Betrachter zu warten und Re-Imaging auf die Zelle danach umgezogen eine neue Ausrichtung. Infolgedessen ist dieses Experiment Zeit- und arbeitsintensiv. Aus diesen Gründen wäre es sehr wünschenswert, automatisierte Methoden zur Erkennung von Stentor Zellen und Phasen der Regeneration im Videomikroskopie Daten zuordnen zu entwickeln. Diese würde auch mehr reproduzierbare Experimente ermöglichen erhöht die Größe der Stichprobe und die Beseitigung der menschlichen Neigung.
Die Entstehung von hochsensiblen Genomik und Proteomik Methoden hat damit begonnen, Studien einzelner Zellen in Reichweite zu stellen. Für solche einzelligen Analysen macht die riesige Größe einer Stentor Zelle es wünschenswert Testperson für Proof-of-Concept-Experimente. Für solche Experimente möglich Kultivierung Stentor ist von grundlegender Bedeutung, und so sollten die hier beschriebenen Methoden eine Rolle in der weiteren Entwicklung von fortgeschrittenen Techniken der einzelligen.

Zellen sind nicht einfache Taschen von Enzymen, sondern eher hochkomplexen Maschinen, deren Komponenten sind sorgfältig auf die richtige Größe skaliert und in klar definierten Positionen angeordnet. Die Morphogenese einzelner Zellen stellt ein Schlüsselprozess in Zell- und Entwicklungsbiologie, aber seine molekulare Mechanismus ist unbekannt1,2. Während einige kultivierten Zellen Blobs ähneln, können einzellige Organismen extrem Architekturen, veranschaulicht durch die komplexe kortikale Muster gesehen in Ciliaten3,4erschwert.
Vielleicht ist das extremste Beispiel einer hochstrukturierten Zelle Stentor Coeruleus, eine riesige Heterotrichous ciliate im Zusammenhang mit weitläufig Tetrahymena und Paramecium. Stentor ist 1 mm lang und ist mit mehr als 100 Längsstreifen der blaue Pigment abwechselnd mit Reihen von Zilien organisiert durch parallele Stapel von Mikrotubuli-Bänder, die die Länge der gesamten Zelle ausgeführt. Die Zelle ist (Abbildung 1), Trompetenförmige mit einer Membranellar-Band und eine mündliche Vorrichtung (OA) an seinem vorderen Ende und einem Holdfast, die das Substrat an seinem hinteren Ende die Zelle beimisst. Neben der klaren anterior-posterioren Polarität zeigt die Zelle auch eine unverwechselbare chiralen Musterung so dass Abstand zwischen ciliary Reihen allmählich steigt im Uhrzeigersinn. Dies führt zu einer Diskontinuität, wo die schmalste Zeile die breiteste Zeile und dieser Region von der Zelloberfläche erfüllt, bekannt als der Ort der Streifen Kontrast, kann induzieren die Bildung des zweiten Satzes der vorderen Ende Strukturen, wenn auf eine andere Zelle5, gepfropft so dass es formal gleichwertig Spemann Veranstalter. Somit haben alle wesentlichen Prozesse der Entwicklungsbiologie ihre Analoga in Stentor: Axiation, Musterbildung und Induktion. In einem Embryo diese Prozesse werden angetrieben durch Schicksal Unterschiede zwischen verschiedenen Zellen, sondern in Stentor, sie müssen durch Schicksal Unterschiede zwischen verschiedenen Regionen innerhalb einer einzelnen Zelle getrieben werden. Was die Unterschiede zwischen den Regionen innerhalb von Stentor definiert, ist ein Rätsel.
Wenn ein Teil des Stentor abgeschnitten wird, kann das fehlende Stück der Zelle regenerieren, um eine normale Zelle in einer Angelegenheit von Stunden zu liefern. Wenn eine Zelle halbieren oder sogar in viel kleinere Stücke schneiden jedes Stück in eine Normal aussehende, aber kleinere Zelle reorganisiert und stellt richtige Proportionalität zwischen Zelle Teile6,7. Auch winzige Fragmente, 1/64th die Größe der ursprünglichen Zelle, sind in der Lage, in eine kleine, aber normal proportionierten Zelle regenerieren und wachsen dann zu voller Größe6. Stentor stellt somit eine einzigartige Gelegenheit zu untersuchen die Mechanismen der Organelle Größe skalieren und Zelle wachstumsregulation mit chirurgischen Methoden, die in der Regel auf der Ebene der Gewebe oder ganze Organismen angewendet werden.
Eine der Eigenschaften von Stentor , die es ermöglicht, aus einer breiten Palette von chirurgischen Eingriffen zu regenerieren ist, dass es einen einzigen Kugelgrafit Macronucleus (Abbildung 1) mit ca. 50.000 Kopien des gesamten Genoms8enthält. Solange eine Zelle Fragment mindestens ein macronuclear Knoten enthält, hat es die Fähigkeit, vollständig zu regenerieren. Eine weitere Eigenschaft, die zugrunde liegenden StentorRegenerationsfähigkeit ist seine ungeheure Wundheilung Fähigkeit. Obwohl viele Zelltypen, die Heilung ihrer Wunden9sind, ist Stentor in der Lage, eine außergewöhnliche Auswahl an physischen Störungen beheben. Ein Beispiel für Stentor Erholung von eine drastische Störung, zusammen mit den Methoden zur Visualisierung von zytoplasmatischen Strömung in Stentor10 wurden bisher gemeldet. Diese Methoden ermöglichen der Studie wie verletzte und die anschließende Regeneration beeinflussen den körperlichen Zustand des Zytoplasmas.
Stentorenorme Größe, außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit und die Tatsache, dass es viele der Entwicklungsbiologie Phänomene gesehen bei mehrzelligen Embryos (z. B. Veranstalter, Axiation und Musterung) manifestiert lockte viele Entwicklungs Biologen während die Wende des letzten Jahrhunderts, darunter Thomas Hunt Morgan7. Während der 50er und 60er Jahren gezeigt mikrochirurgische Ansätze eine überraschende Auswahl an regenerativen und morphogenetischen Prozesse in dieser einzelligen Organismus11. Jedoch hat Stentor als Modellsystem Molekularbiologie erst vor kurzem entwickelt worden. In den vergangenen Jahren das Genom des Stentor wurde sequenziert und8montiert, und die Methode, die Genexpression RNAi durch die Fütterung mit Radardetektoren war entwickelten12.
Vor kurzem war einer der Gründe, dass Stentor in ein Modellorganismus für die moderne Molekularbiologie nur entwickelt wurde die Schwierigkeit der wachsenden großen Kulturen aufgrund seiner langen Zellzyklus (3-5 Tage). Moderne genomische und Proteomik Methoden erfordern jedoch weniger Material als früher und das Volumen von einer Einzelzelle Stentor für diese Methoden reicht auch ohne Rückgriff auf Gromer Methoden, die entwickelt wurden, für die Analyse der einzelnen Zellen, die viel kleiner sind als Stentor. Abschnitt 1 des Protokolls beschreibt das Verfahren für den Aufbau einer großen Kultur aus einer einzigen Zelle Stentor . Der gleiche Ansatz lässt sich eine große Kultur aus einer Zelle Fragment erhalten durch Schneiden einer Zelle zu etablieren. Abschnitt 1 enthält auch die Richtlinien für die Aufrechterhaltung der gesunder Stentor Kulturen über lange Zeiträume hinweg. Abschnitt 2 des Protokolls bietet die Methodik zur Induktion Zellregeneration durch Schneiden die Zellen manuell mit einer glasnadel. Abschnitt 3 des Protokolls widmet sich zwei Methoden der Induktion der Regeneration der spezifischen Zellstrukturen (Membranellar Band und Oral Apparate): Behandlung der Zellen mit Saccharose oder Harnstoff führt bis zum Vergießen von diesen Strukturen, gefolgt von ihrer Regeneration. Abschnitt 4 des Protokolls beschreibt eine Methode für die Darstellung der einzelnen regenerierenden Zellen über lange Zeiträume hinweg. 4. Abschnitt endet mit der Beschreibung der Phasen der Regeneration und Tipps für die Analyse der Dynamik der Regeneration.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

Zellen müssen in der Lage sein, ihre Teile wieder aus externen Störungen zu regenerieren. Die einzelligen ciliate Stentor Coeruleus ist eine ausgezeichnete Modellorganismus Wundheilung zu studieren und anschließende Zellregeneration. Das Stentor Genom wurde kürzlich, zusammen mit modernen molekularbiologischen Methoden, wie z. B. RNAi. Diese Tools machen es möglich, einzelne Zelle Regeneration auf molekularer Ebene zu untersuchen. Der erste Abschnitt des Protokolls umfasst Aufbau Stentor Zellkulturen aus einzelnen Zellen oder zellfragmente, zusammen mit allgemeinen Leitlinien für die Aufrechterhaltung der Stentor Kulturen. Kultivierung von Stentor in großen Mengen ermöglicht die Verwendung von wertvollen Tools wie Biochemie, Sequenzierung und Massenspektrometrie. Nachfolgende Abschnitten des Protokolls decken verschiedene Ansätze zur Regeneration bei Stentorinduzieren. Zellen mit einer glasnadel manuell schneiden ermöglicht die Regeneration der großen Zelle teilen, zu studieren, während Behandlung von Zellen mit Saccharose oder Harnstoff ermöglicht die Regeneration der spezifischen Strukturen befindet sich am vorderen Ende der Zelle zu studieren. Ein Verfahren zur Bildgebung regenerierende Einzelzellen sowie eine Rubrik für die Inszenierung und Analyse der Dynamik der Regeneration zur Verfügung gestellt. Der gesamte Prozess der Regeneration ist in drei Stufen unterteilt. Durch die Visualisierung der Dynamik der Entwicklung einer Bevölkerung der Zellen durch die Stadien, zeigt sich die Heterogenität in Regeneration Timing.

Stentor Kulturen wurden zuverlässig eingerichtet und gepflegt von Einzelzellen oder zellfragmente mit Abschnitt 1 des Protokolls. Video 1zeigt ein repräsentatives Beispiel für eine große gesunde Kultur.
Der zeitliche Verlauf der Regeneration wurde in Stentor mit Saccharose-Behandlungsmethode für die Initiierung der Regenerierung gemäß Schritt 3.1, kombiniert mit der Bildgebung und Analysemethode diskutiert in Abschnitt 4 (Abbildung 7) gemessen. Dieses Diagramm zeigt, dass gibt es eine eine-Stunde-langen Ausbreitung in die Zeit von der Bevölkerung der Zellen für eine bestimmte Stufe zu erreichen. Diese Art der Analyse ermöglicht die Untersuchung der zeitlichen Heterogenität in den Regenerationsprozess in einer Population von Zellen zu regenerieren.
Nachfolgend eine Zusammenfassung der Regeneration-Timing, die bisher nach Dutzenden von Saccharose Behandlungen (Abbildung 4 und Abbildung 6) beobachtet wurden. Phase 1 ist, wenn Tränen ohne jede Membranellar Band Stentor Zellen aussehen (diese Etappe beginnt unmittelbar nach der Saccharose Auswaschen). Diese Phase dauert ca. 3-6 h Stufe 2 ist, wenn eine Membranellar Band erscheint und wächst (3-6 h nach der Saccharose-Behandlung). Diese Phase dauert ca. 3-4 h. Phase 3 ist, wenn eine orale Primordium am hinteren Ende des Membranellar Bandes (6-8 h nach der Saccharose-Behandlung erscheint), und beide Strukturen sind am vorderen Ende der Zelle verschoben. Diese Phase dauert ca. 1-2 h. Wenn die Membranellar Band und der mündlichen Apparat am vordere Ende der Zelle erreicht, dies angegeben die Vollendung der Regeneration. Die Zelle hat charakteristische Stentor trompetenartige Form angenommen. Zellen wurden komplett regenerierte 8-9 h Saccharose Nachbehandlung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> Abbildung 1. Snapshot von Stentor. Die Membranellar Band und der mündlichen Apparat sind am vorderen Ende der Zelle angezeigt. Die Holdfast ist am hinteren Ende der Zelle. Stentor Macronucleus ist Kugelgrafit. Eine gut genährte Stentor hat grüne Lebensmittel Vakuolen enthalten meist Chlamydomonas. Maßstabsleiste beträgt 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Abbildung 2: Stentor schneiden Set-up. Zelle Schneiden erfolgt manuell bearbeiten einer glasnadel beim Betrachten der Zelle mit einem handelsüblichen sezierenden Stereo-Mikroskop. Das Seidenpapier dient den weißen Hintergrund um zu sehen, die Zellen besser angeben. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> Abbildung 3. Schnappschüsse von Video 3 darstellen, wie ein Stentor mit einer glasnadel schneiden. (A) A Stentor unmittelbar vor die Nadel, die er berührt. (B) ein Stentor drückte sanft zwischen Nadel und Glas Folie. (C) A beauftragt Stentor als Reaktion auf die Kraft der Nadel. (D) A Stentor durch leichtes Drücken auf die Zelle mit der Seite der Nadel geschnitten. (E) A Stentor jetzt in zwei Teile geschnitten, aber nicht getrennt. (F) zwei Stentor Fragmente. Maßstabsleiste ist 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Abbildung 4. Schematische Darstellung von Abschnitt 3 und Abschnitt 4 des Protokolls. Dies ist eine illustrierte Protokoll zur Durchführung von Saccharose oder Harnstoff-Behandlung und Beobachtung der Zellregeneration. Die Zeitangabe im unteren Bereich wird von Anfang an die Wäsche 1 gemessen. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Abbildung 5. Das Setup für Bildgebung und/oder direkte Beobachtung der Regeneration mit einem aufrechten Mikroskop. In jeder 4 µL Tropfen von dem Deckglas hängen gibt es eine Zelle Regeneration unterzogen. Wasser in den Brunnen der Glasplatte vor Ort begrenzt Verdunstung der Tröpfchen. Dieses Setup ermöglicht nach der Regeneration von mehreren Zellen parallel. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> Abbildung 6. Schnappschüsse von Stentor in den einzelnen Phasen der Membranellar Band und die mündliche Apparat Regeneration. (A) Stufe 1 zeichnet sich durch eine Träne-wie Zellform und das Fehlen der Membranellar Band. (B) Stufe 2 zeichnet sich durch die Darstellung der Membranellar Band, ein Zilien-basierte Struktur, die ständig schlägt. Membranellar Bänder sind gekennzeichnet mit weiße gestrichelte Linien in Platten B - D. (C und D) Stufe 3 zeichnet sich durch die Darstellung der mündlichen Primordium (mit einem Pfeil markiert). Mündliche Primordium sieht aus wie eine Einschnürung am hinteren Ende der Membranellar Band. Die mündliche Primordium wird dann in Richtung der vorderen Zelle Aufsteigen zu den mündlichen Apparat. (E) Regeneration ist abgeschlossen, wenn die Zelle das Merkmal Stentor trompetenartige Form angenommen hat, und die mündliche Vorrichtung (mit einem Pfeil markiert) hat am vorderen Ende der Zelle erweitert. Maßstabsleiste ist 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Abbildung 7. Box-Plot zeigt gestapelt wie Proportionen von Zellen in allen Phasen der Regeneration nach der Saccharose Behandlung über zeitliche Veränderungen. Die Grafik zeigt die Heterogenität des Zeitpunkts der Regeneration Phasen innerhalb einer Population von regenerierenden Zellen. "Reg End" zeigt die Fertigstellung der Regeneration. Die Anzahl der Zellen: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Video 1. Beispiel für eine gesunde Kultur Stentor . In der Regel, wenn eine Kultur das konzentriert ist, teilen der Kulturkreis empfiehlt. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Video 2. Verlangsamt sich Stentor mit Methylcellulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Video 3. Schneiden Stentor. Einzelne Zellen können manuell in mehrere Stücke unter einem Stereo Mikroskop durch Drücken einer glasnadel durch die Zelle zu sezieren geschnitten werden. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problem mit Kultur</td>
			<td>Mögliche Abhilfe</td>
			<td>Mögliche Prävention</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kultur wird von Rädertierchen oder andere große Organismen überwältigt.</td>
			<td>Entfernen Sie so viele Stentor wie möglich in eine neue Kulturschale. Dann waschen Sie die Zellen dreimal.</td>
			<td>Waschen Sie Stentor gründlich, wenn sie, zu empfangen, selbst wenn sie von einem kommerziellen Anbieter zu kaufen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kultur ist durch Pilz oder andere kleinen Organismen überwältigt.</td>
			<td>Identifizieren eine Ecke wo gibt es die am wenigsten Stentor. Entfernen Sie in diesem Bereich, so viel Medien möglichst ohne viele Stentor und fügen Sie neue PSW. Mischen Sie sanft aber gründlich zu Jahrgangsstufe die eindringenden Organismen. Überspringen Sie die nächste Fütterung und Stentor Essen sie.</td>
			<td>Die Kultur regelmäßig beobachten und durch den Austausch von Medien für frische PSW kleine Verunreinigungen zu entfernen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor liegen übereinander.</td>
			<td>Teilen Sie die Kultur, so dass die Konzentration weniger als 20 Zellen/mL beträgt.</td>
			<td>Immer öfter Kulturen aufgeteilt.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor Zellen sind Paarung.</td>
			<td>Alle 4 Tage statt alle 5 Tage zu ernähren.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kultur hat eine Menge von dunklen Abfallmaterial.</td>
			<td>Entfernen Sie so viel des dunklen Materials, Stentor Abfälle wie möglich ohne die Zellen zu entfernen. Wenn das dunkle Material Stentor zugeordnet sind, pipette rauf und runter um die Stentor Zellen aus ihrer Abfälle lösen und entfernen dann das Medium mit dem Abfall ohne die Zellen zu entfernen. Oder entfernen Sie die Stentor und entsprechend füttern weniger.</td>
			<td>Feed Stentor 1 mL weniger Nahrung pro 100 mL der Kultur.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Auf der Suche von fehlerhaft (vakuolisierten/aufgebläht oder gerundet) Stentor.
</td>
			<td>Entfernen Sie so viel Medien wie möglich ohne zu viele Stentor Zellen entfernen und fügen Sie neuer PSW hinzu.</td>
			<td>Tauschen Sie die Medien regelmäßig.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Handbuch zur Problembehandlung für die Kultivierung von Stentor.

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Die riesigen Ciliate Stentor Coeruleus, ist ein ausgezeichnetes System zu studieren Regeneration und Wundheilung. Wir stellen Verfahren zur Einrichtung Stentor Zellkulturen aus einzelnen Zellen oder zellfragmente, Regenerierung durch Schneiden Zellen induzieren, chemisch induziert die Regeneration von Membranellar Band und mündliche Apparatur, Bildverarbeitung und Analyse der Zelle Regeneration.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K Aufrufe.  University of California San Francisco. Die riesigen Ciliate Stentor Coeruleus, ist ein ausgezeichnetes System zu studieren Regeneration und Wundheilung. Wir stellen Verfahren zur Einrichtung Stentor Zellkulturen aus einzelnen Zellen oder zellfragmente, Regenerierung durch Schneiden Zellen induzieren, chemisch induziert die Regeneration von Membranellar Band und mündliche Apparatur, Bildverarbeitung und Analyse der Zelle Regeneration.

Serie: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Ein Mausmodell der Stentimplantation in der Arteria carotis für das Studium der Restenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Medizin

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Untersuchung funktionelle Regeneration im Organotypische Spinal Cord Co-Kulturen auf Multi-Elektroden-Arrays Grown

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Neurowissenschaften

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Biologie

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein standardisiertes Mausmodell der extrakorporalen Stoßwellentherapie-induzierten Weichteilregeneration

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Ein standardisiertes Mausmodell der extrakorporalen Stoßwellentherapie-induzierten Weichteilregeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Zusammenfassung

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Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Ein standardisiertes Mausmodell der extrakorporalen Stoßwellentherapie-induzierten Weichteilregeneration

Ein standardisiertes Mausmodell der extrakorporalen Stoßwellentherapie-induzierten Weichteilregeneration

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in