Estudar a habituação no nível de uma única célula ajudará a caracterizar paradigmas de aprendizagem que são independentes de circuitos neurais complexos, ajudando-nos a entender as origens da inteligência. Esta técnica permite que a força e a frequência da estimulação mecânica entregue às células sejam variadas sob controle automático do computador, aumentando consideravelmente a diversidade de sequências de entrada. Usar esses métodos para estudar a habituação celular nos ajudará a aprender mais sobre condições como TDAH e Síndrome de Tourette, nas quais a habituação é prejudicada.
Para começar, prenda o condutor do motor ao motor ligando os dois fios rotulados A da placa do condutor aos fios azuis e vermelhos do motor. Em seguida, conecte os dois fios rotulados B da placa do motorista aos fios verde e preto no motor. Depois de construir o circuito da breadboard com especial cuidado para conectar os LEDs na polaridade correta, conecte o VCC da placa do driver ao trilho superior da breadboard branca.
E o chão da placa do motorista até o trilho inferior da prancha. Em seguida, conecte o solo da breadboard ao pino de aterramento da placa microcontroladora. Em seguida, conecte os fios de LED verde, LED vermelho, interruptor e botão, respectivamente, aos pinos digitais da placa microcontroladora 8, 9, 10 e 11.
Conecte os pinos digitais dois e três da placa do microcontrolador aos fios, passo e direção da placa do driver. Em seguida, conecte o pino quatro ao MS1, o pino cinco ao MS2, o PIN seis ao MS3 e o pino sete para habilitar. Para alimentar a placa do driver, conecte a fonte de alimentação de 12 volts ao plugue do adaptador verde preto, conectado por dois fios vermelhos à placa do driver do motor.
Baixe o programa de controle na placa microcontroladora. Use um cabo USB para conectar a placa microcontroladora a um computador, que também servirá como fonte de alimentação para a placa microcontroladora. Após a obtenção do Stentor, revestir uma placa de 35 milímetros adicionando três mililitros da solução de poliornitina a 0,01% à placa e deixar durante a noite.
Lave o prato duas vezes com água ultrapura e uma vez com água de nascente pasteurizada. Em seguida, adicione 3,5 mililitros de água de nascente pasteurizada à placa de 35 milímetros. Adicione três mililitros de água de nascente pasteurizada ao primeiro poço e cinco mililitros ao segundo e terceiro poços.
Usando uma pipeta P1000, adicione dois mililitros de Stentor de um prato de cultura ao primeiro poço da placa de seis poços. Identifique o Stentor individual com um microscópio estéreo e, em seguida, use uma pipeta P20 para transferir 100 Stentor do primeiro poço para o segundo poço. Da mesma forma, depois de identificar o Stentor individual com um microscópio estéreo, como demonstrado anteriormente, transfira 100 Stentor do segundo poço para o terceiro poço usando uma pipeta P20.
Em seguida, usando uma pipeta P200, transfira 100 Stentor em um volume total de 500 microlitros, do terceiro poço da placa de seis poços para a placa de 35 milímetros, de modo que o volume final seja de quatro mililitros. Cole um pedaço de papel branco na régua de metal no dispositivo de habituação, garantindo que a borda esquerda do papel esteja a dois centímetros da extremidade da régua mais próxima da armadura. Usando fita dupla face, cole a parte inferior da placa de 35 milímetros ao centro das duas por dois centímetros de papel em cima da régua no dispositivo de habituação.
Deixe a placa de 35 milímetros no dispositivo de habituação durante pelo menos duas horas com a tampa fechada. Centralize a câmera do microscópio USB diretamente acima da placa de 35 milímetros do Stentor. Para instalar o aplicativo gravador de webcam, abra o aplicativo gravador de webcam e selecione o microscópio USB no menu suspenso.
Ajuste o foco na câmera do microscópio USB para que as células estejam claramente à vista e a posição da câmera para maximizar o número de células no campo de visão. Depois de abrir o monitor serial da placa microcontroladora, selecione nenhuma terminação de linha "e defina-o como 9, 600 baud. Use o comando L no programa da placa do microcontrolador para abaixar a armadura até que ela mal toque na régua e o comando R para levantar o braço, se necessário, para ajustar a posição exata.
Use o comando I para inicializar o modo automático no dispositivo de habituação. Insira o tamanho das etapas e o tempo entre os pulsos em minutos na linha de comando. Comece a gravar um vídeo usando o aplicativo gravador de webcam pressionando o botão vermelho de gravação.
Em seguida, ligue o interruptor no aparelho de habituação para iniciar o experimento com a primeira entrega automatizada de pulsos mecânicos. Imediatamente antes que o primeiro pulso mecânico apareça no vídeo, pause e conte o número de Stentor que estão ancorados na parte inferior da placa de 35 milímetros e estendidos em uma forma alongada semelhante a uma trombeta. Da mesma forma, após o primeiro pulso, conte o número de Stentor que estão ancorados na parte inferior da placa e contraídos em uma forma de bola.
Divida a segunda contagem pela primeira contagem para determinar a fração de Stentor que se contraiu em resposta ao estímulo mecânico, enquanto repete o procedimento para todos os pulsos mecânicos do experimento. A probabilidade de contração do Stentor foi monitorada e os resultados demonstraram que ele diminui progressivamente ao longo de uma hora. Depois de receber pulsos mecânicos de nível quatro a uma frequência de um toque por minuto, indicando habituação.
Alterar a força ou a frequência da entrega do pulso mecânico pode alterar a dinâmica de habituação do Stentor. Ao usar o conjunto de pulso de nível dois de frequência de um toque por minuto, impede a habituação ao longo de uma hora. Podemos estudar diferentes tipos de dinâmica de habituação alterando a força e a frequência da estimulação mecânica.
Esta é uma oportunidade para explorar diferentes tipos de aprendizagem, como a sensibilização. Insights quantitativos sobre o aprendizado de células únicas, obtidos a partir de nossos métodos, poderiam inspirar outros caminhos para a reprogramação de células dentro de tecidos multicelulares. Outra maneira potencial de combater doenças.
