Stentor coeruleus wird seit langem als Modellorganismus eingesetzt, um die einzellige Regeneration zu verstehen. Während der Zeitplan für die visuelle morphologische Regeneration bekannt ist, bleibt der Zeitplan für die funktionelle Regeneration unbekannt. Dieser Assay verfolgt die Motilität der Zentrumspopulation, die einer synchronisierten Regeneration unterzogen wird, so dass die Wiederherstellung der Verlustfunktion quantifiziert werden kann.
Es kann für die Verwendung mit anderen Zelltypen angepasst werden. Das Fehlen einer sicheren Abdichtung der Bildgebungskammer führt dazu, dass Brunnen ineinander eindringen oder sich Luftblasen in den Bohrlöchern bilden. Für Forscher, die mit der Verwendung von Silikonabstandshaltern nicht vertraut sind, empfehlen wir dringend, PSW oder ein anderes sauberes Medium in jede der Vertiefungen zu pipettieren, um vor dem Gebrauch auf Leckage zu testen.
Der Aufbau der Probenkammern ist leichter dargestellt als verbal beschrieben. Ebenso wie der Prozess zum Extrahieren von Motilitätsmustern aus den erfassten Videodaten. Schneiden Sie zunächst ein Stück 250 Mikrometer dickes Silikon-Abstandshalterblatt etwas kleiner in Höhe und Breite als ein Objektträger.
Verwenden Sie einen ganzen Stempel, um kreisförmige Brunnen zu erstellen, die genügend Platz zwischen benachbarten Bohrlöchern lassen, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. Initiieren Sie die Regeneration des oralen Apparates, indem Sie Stentor coeruleus-Zellen in 10% Saccharose oder 2% uria für zwei Minuten inkubieren. Dann dreimal mit frischem Medium waschen.
Pipettieren Sie vorsichtig ca. 10 Stentor in jedes Bohrloch. Achten Sie darauf, das Probenvolumen so genau wie möglich an das Bohrlochvolumen anzupassen. Schließen Sie die Brunnen, indem Sie ein Stück Deckglas von einer Kante aus vorsichtig über die Vertiefungen senken.
Verwenden Sie ein schmales und leicht flexibles Objekt, z. B. eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um auf das Deckglas zu drücken, wo es die Silikonplatte berührt, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und stellen Sie das Mikroskop auf die niedrigste verfügbare Vergrößerung ein, so dass eine gut in den Rahmen passt. Beginnen Sie den Zeitraffer und erfassen Sie zu jedem Zeitpunkt ein zehnsekündiges Video mit 30 Bildern pro Sekunde jedes Bohrlochs.
Erfassen Sie zur Kalibrierung ein klares Bild eines Kalibrierungsobjektträgers oder eines klaren Lineals mit den gleichen Vergrößerungseinstellungen wie die Videos. Zählen Sie mit einem beliebigen Bildbetrachtungsprogramm die Anzahl der Pixel zwischen Markierungen einer bekannten physikalischen Entfernung. Laden Sie die beiden Skripte herunter, verfolgen Sie Zellen und bereinigen Sie Spuren an einen leicht zu merkenden Ort auf dem Computer und übertragen Sie die Datenvideos ebenfalls auf diesen Computer.
Organisieren Sie die Datenvideos in Ordnern. Eine für jeden Zeitpunkt. Verwenden Sie das Skript Track-Zellen, um eine automatisierte Zellverfolgung in den Datenvideos durchzuführen, indem Sie Track-Zellen öffnen und das Skript Choose add to path" ausführen, wenn Sie von einem Popup-Fenster dazu aufgefordert werden, was normalerweise nur geschieht, wenn das Skript zum ersten Mal von einem bestimmten Ordner ausgeführt wird.
Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie ein oder mehrere Datenvideos aus, um das Tracking zu initiieren. Navigieren Sie zu den Datenvideos und sobald Sie mit der Liste der Dateien zufrieden sind, klicken Sie auf Öffnen"Um anomale oder falsche Spuren manuell abzulehnen, öffnen Sie saubere Leiterbahnen im MATLAB-Editorfenster, indem Sie auf die Datei doppelklicken. Wählen Sie an der Eingabeaufforderung den Datenordner aus, der von den Gleiszellen ausgegeben wird.
Navigieren Sie zu einem der erstellten Ordner und wählen Sie ihn aus. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie eins ein, um die Ablaufverfolgung beizubehalten, und Null, um die Ablaufverfolgung abzulehnen. Drücken Sie dann die EINGABETASTE, um zur nächsten Ablaufverfolgung überzugehen.
Beginnen Sie mit dem Herunterladen des Skripts mit dem Titel Spaghetti Plots. Öffnen Sie das Skript, und führen Sie es aus. Wenn das Dateibrowserfenster mit der Eingabeaufforderung angezeigt wird, wählen Sie den zu öffnenden Ordner aus.
Navigieren Sie zum Ordner eines der Zeitpunkte. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, Kalibrierung, wie hoch ist die Anzahl der Pixel pro Millimeter? Geben Sie den Kalibrierungswert ein und drücken Sie die Eingabetaste.
Passen Sie die Achsen des Plots nach Bedarf an, indem Sie Zeile 55 des Skripts ändern, die standardmäßig auf RR gleich vier gesetzt ist. für die Einbeziehung eines Radius von bis zu vier Millimetern. Speichern Sie die Handlung.
Die Ergebnisse zeigen die kollektive Motilität der Stentorzellpopulation nach zwei, drei, sieben und acht Stunden nach dem Regenerationsprozess des oralen Apparates. Diese Diagramme zeigen sowohl die erwartete Zunahme der Anzahl der beweglichen Individuen als auch die Vervierfachung der Reichweite der beweglichsten Zellen innerhalb der Population. Die schnellsten schwimmenden Zellen sind, wenn sie in der Nähe des Randes gestartet werden, daran gehindert, vollständig in einer geraden Linie zu schwimmen, und ihr Bewegungsumfang erscheint kleiner.
Die Traktzellen wurden in drei verschiedene Kategorien eingeteilt: nicht beweglich ohne sichtbaren Halt, nicht beweglich mit sichtbarem Halten und beweglich. Das Ergebnis zeigte ein gestapeltes Histogramm, das die relative Zellzahl über diese Kategorien als Funktion von uns in der Regeneration zusammenfasst. Zu späteren Zeiten wurde eine beträchtliche Anzahl von Zellen in Kolonien mit sichtbaren Halteklammern gefunden, was stark darauf hindeutet, dass sie die Umwelt erkundet und bevorzugt in der Nähe von anderen ihrer Art befestigt hatten.
Es ist wichtig, die Probenbohrlochmaße auszuwählen, die für Stentor coeruleus, die etwa einen Millimeter groß sind, gut geeignet sind. Dazu gehören Silikon-Abstandshalter-Dicke 5/16 Zoll im Durchmesser und 10 Zellen pro Well. Diese Zahlen sollten angepasst werden, wenn dieses Protokoll für andere Zelltypen angepasst wird.
Dieser Assay kann in Verbindung mit RNA-I durchgeführt werden, um die Regeneration verschiedener Stentor Phänotypen zu untersuchen und zu vergleichen.
