Dieses Protokoll stellt eine mehrstufige Methode dar, sowohl für den EST-Nachweis als auch für die Phagenfigur. Außerdem wurde ein großer Index für Speicherungen eingeführt, um die EMR-Werte verschiedener Steuerungstechnologien zu vergleichen. Diese kostengünstige Technik ist intelligent, durchsatzhoch und multifunktional.
Es ermöglichte den Aufbau von VAMS, einem veterinärmedizinischen Überwachungsnetzwerk, das 20.000 Epidemiegene und analytische Phagen gesammelt hat. Diese Methode kann auch zur Überwachung und Bekämpfung pathogener Bakterien in der Medizin, Landwirtschaft, Tierherzbatterie und Fischerei eingesetzt werden. Dieses Protokoll und dieses Unternehmenspapier sollten vorsehen, dass ein.
Wir mit technischem Schulungsleitfaden. Es zu befolgen, würde jedem helfen, die Technik in kurzer Zeit zu beherrschen. Beginnen Sie mit der Inkubation des Qualitätskontrollorganismus E. coli und 93 Testsalmonellenstämmen auf Mueller-Hinton-Agarplatten.
Als nächstes wird das vorbereitete Inokulum jedes Stammes 10-mal verdünnt. Als Negativkontrolle werden 200 Mikroliter sterile normale Kochsalzlösung in die A-1-Vertiefung einer 96-Vertiefungsplatte übertragen. Anschließend werden zwei Suspensionen von E. coli als Positiv- bzw. Qualitätskontrolle in die Vertiefungen a-2 und a-3 pipettiert.
Zu den verbleibenden 93 Vertiefungen werden 200 Mikroliter des verdünnten Teststamms hinzugefügt. Zur Herstellung der antimikrobiellen Agarplatten. Legen Sie zunächst die Konzentrationsbereiche für die verschiedenen zu testenden antibakteriellen Wirkstoffe gemäß dem LAR-Index fest.
Führen Sie ein log-zwei-Verdopplungsverdünnungsschema für die Antibiotikalösung nach der CLSI-Standard-Agar-Verdünnungsmethode durch. Geben Sie nun zwei Milliliter der antimikrobiellen Lösung in eine sterilisierte Glasflasche, die 18 Milliliter geschmolzenes Mueller-Hinton-Agar-Medium enthält. Nach gründlichem Mischen in Platten in einer Bio-Sicherheitswerkbank füllen.
Lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur erstarren. Achten Sie darauf, einen Spalt unter dem Deckel der Platten zu lassen, damit die Agaroberfläche getrocknet werden kann. Beschriften Sie die Arten der antimikrobiellen Wirkstoffe und ihre jeweiligen Konzentrationen auf der Unterseite der inkubierten Platten.
Ordnen Sie die mehrfach inkubierten Platten für jedes antimikrobielle Mittel in einem Stapel an, der in logarithmischer Verdünnungsreihenfolge zwei angeordnet ist. Zum Schluss bereiten Sie zwei arzneimittelfreie Agarplatten vor, die als Kontrollen für jeden Wirkstoff dienen. Installieren Sie eine sterilisierte Impfstiftplatte auf dem Träger eines 96-Punkt-Matrix-Inokuultators in einer Biosicherheitswerkbank.
Als nächstes ordnen Sie den vorbereiteten Saatgutblock mit den getesteten Stämmen und einer Agar-Inkubationsplatte auf dem mobilen Träger an. Schieben Sie den mobilen Träger, bis sich der Saatblock unter der Impfstiftplatte befindet. Drücken Sie nun auf den Bediengriff und senken Sie die Impfstiftplatte ab, wobei Sie die 96 Stifte in Richtung des Inokulums in den 96 Vertiefungen des Saatblocks führen.
Lassen Sie den Bediengriff kontrolliert los und setzen Sie die Impfstiftplatte automatisch zurück, um jedes Inokulum gut umzurühren und den Bediengriff zwei- bis dreimal zu drücken. Verschieben und positionieren Sie anschließend die Trägerplatte so, dass sich die Inkubationsplatte unter der Impfstiftplatte befindet. Drücken Sie den Bediengriff nach unten, senken Sie die Impfstiftplatte ab und lassen Sie sie ein bis zwei Sekunden lang stehen, um vollen Kontakt mit der Oberfläche der Inkubationsplatte zu gewährleisten.
Lassen Sie den Bediengriff los, um eine Impfrunde abzuschließen. Setzen Sie die inkubierte Platte wieder ein und wiederholen Sie den Vorgang, bis die Charge der antimikrobiellen Agarplatten vollständig ist. Wechseln Sie zu einer neuen Impfnadelplatte und einem neuen Saatblock, um eine weitere Gruppe getesteter Stämme zu impfen.
Inkubieren Sie die inokulierten antimikrobiellen Agarplatten bei Raumtemperatur, bis die Feuchtigkeit aus den Inokulumflecken vollständig in den Agar aufgenommen ist. Nach der Inkubation werden die Platten umgedreht und die Inkubation fortgesetzt, damit ungehemmte Bakterien Kolonien bilden können. Um Bildaufnahmen und Datenstatistiken durchzuführen, klicken Sie zunächst auf das 96-Punkt-Matrix-AST-Bilderfassungssystem, um das Programm zu starten.
Wählen Sie in der Taskleiste Testinformationen aus. Klicken Sie auf Neu, um eine neue Testaufgabe zu erstellen, und geben Sie die erforderlichen Details ein. Drücken Sie dann auf Datenerfassung, gefolgt von Foto und Testobjekt, um die neu erstellte Aufgabe auszuwählen.
Wählen Sie Antibiotika, um den Namen des Antibiotikums auszuwählen, und den Gradienten, um die Anfangskonzentration des Antibiotikums auszuwählen. Klicken Sie abschließend auf Verbinden, um eine Verbindung mit dem Bildaufnahmekonverter herzustellen. Legen Sie dann die inkubierten Platten auf die Basis der Detektionsplatte und setzen Sie sie in den Bildaufnahmekonverter ein.
Klicken Sie auf Sammlung, um Bilder der Platten aufzunehmen. Drücken Sie auf Antibiotika und wählen Sie den nächsten Satz Platten aus. Wählen Sie Farbverlauf, um den Anfangsverlauf zu identifizieren, und fahren Sie dann mit der nächsten Runde der Bilderfassung fort.
Schließen Sie den Vorgang ab, indem Sie auf "Senden" klicken, um die Koloniebildung zu bestimmen und die Bilder in minimale Hemmkonzentrationen, d. h. MIC-Werte, umzuwandeln. Klicken Sie auf Abfrage, um auf alle MIC-Ergebnisse zuzugreifen. Beginnen Sie mit der Verwendung der Doppelschicht-Agar-Methode, um verschiedene Phagen herzustellen.
Verdünnen Sie die Phagen auf eine geeignete parallele Konzentration und fügen Sie 200 Mikroliter des Phagen-Inokulums in den 96-Well-Samenblock hinzu. Bereiten Sie als Nächstes eine doppellagige Inkubationsplatte für jeden zu untersuchenden Stamm vor. Lassen Sie eine Lücke unter dem Deckel der doppellagigen Platte, damit sie trocknen kann.
Legen Sie den vorbereiteten Phagen-Seed-Block und die doppellagige Platte auf den mobilen Träger des 96-Punkt-Matrix-Inokuultors. Übertragen Sie alle Phagen-Inokular auf die Semi-Agar-Oberfläche. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur stehen, bis die gesamte inokuläre Feuchtigkeit in den Semi-Agar aufgenommen wurde.
Inkubieren Sie nun die Platten bei 37 Grad Celsius für die getesteten Stämme für vier bis sechs Stunden. Verwenden Sie den Bildaufnahmekonverter, um das Bild des experimentellen Ergebnisses jeder Doppelschichtplatte zu erhalten und zu speichern. Erfassen Sie die Anzahl und Morphologien der verschiedenen Spotformen in einer Tabelle auf der Grundlage der erhaltenen Bilder und berechnen Sie die jeweiligen Proportionen der verschiedenen Phagentypen.
Die morphologische Untersuchung des Salmonellenwachstums auf Platten mit Ampicillin zeigte, dass die Negativkontrolle in a-1 kein Wachstum zeigte. Die MHK des Salmonellenstamms in a-4 betrug 64 Mikrogramm pro Milliliter, während die von a-5 16 Mikrogramm pro Milliliter betrug. Die prozentualen Resistenzwerte von Ampicillin, Ciprofloxacin und Amoxicillin-Clavulansäure lagen bei mehr als 50 %, während die von Doxycyclin, Florfenicol, Cefotaxim und Enrofloxacin bei 30 % bis 50 % lagenGentamicin, Amikacin und Meropenem zeigten prozentuale Resistenzwerte von weniger als 30 %Die LAR-Indizes von Ciprofloxacin und Amoxicillin-Clavulansäure verzögerten sich signifikant.
Morphologische Analysen des Salmonellenwachstums auf Doppelschichtplatten zeigten, dass vier Hauptfleckmorphologien von Phagen beobachtet wurden. Der runde, klare lytische Fleck stammte von einem Phagen, der den Wirt auf der Platte zuverlässig töten konnte, sich aber auf Kosten dieses Wirts erfolgreich replizieren konnte oder auch nicht. Die Sammlung von Plaques wurde von echten Plaques gebildet.
Der trübe lytische Fleck resultierte aus einem Phagen, der den Wirt auf der Platte nicht zuverlässig tötete und der sich auf Kosten dieses Wirts erfolgreich replizieren kann oder auch nicht. Das Fehlen eines lytischen Flecks deutete auf eine nicht-lytische Natur hin. Diese Technik überträgt problemlos und effizient 96 Agarlinsen auf einmal und das Gerät erkennt automatisch Bilder und berechnet dann die Linienwürfel.
Es wird erwartet, dass diese Technologie die Erforschung und Industrialisierung von Phagen fördern wird, und die Anwendung von Phagen ist eine der erstaunlichen Möglichkeiten, das Problem der AMR zu reduzieren und zu lösen.
