Die Zersetzung von Fettgewebe in Subtypen war aufgrund der zerbrechlichen Natur von Adipozyten eine Herausforderung. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um dies durch eine effektive Isolierung einzelner Kerne zu überwinden. Dieser Workflow bietet hochgereinigte Einzelkerne mit minimierten Kernaggregaten und zellulären Ablagerungen.
Dies ist vorteilhaft für einzellige Transkriptom-Profile von Tausenden von Zellen. Dieses einfache und robuste Protokoll kann angewendet werden, um die Organisation von Adipozyten auf Gewebeebene in ihren adipose residenten Zellen zu untersuchen. Und insbesondere zur Entwicklung von Phänotypisierung, Fettknockout und transgenen Mäusen.
Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, damit Personen, die nicht über viel Erfahrung im Umgang mit Adipozyten verfügen, die Heterogenität von Adipose replizieren und einblickindieeen können. Nachdem Sie Fettgewebe von Mäusen gesammelt haben, klopfen Sie es mit einem Papiertuch trocken und legen Sie es in eine saubere Schale. Calciumchlorid in den Verdauungspuffer zu einer Endkonzentration von 10 mM geben.
Dann fügen Sie ein kleines Volumen in das Gewebe und gründlich Hackfleisch. Fügen Sie etwa die Hälfte der Menge des vorbereiteten Verdauungspuffers in das gehackte Gewebe. Und verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Probe in ein 50 ml Zentrifugenrohr zu übertragen.
Waschen Sie die Schale mit dem restlichen Puffer und fügen Sie sie dem 50 ml Rohr hinzu. Pipette die Probe auf und ab mehrmals. Dann bebrüten Sie es für 12 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, während es bei 200 bis 210 Rpm schüttelt.
Nach der Inkubation 0,5%BSA zu der Probe bei einem Volumenverhältnis von 1 bis 1 hinzufügen und durch Pipettieren gut mischen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 xg für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die stromovaskuläre Fraktion zu drehen und die Adipozytenfraktion oben zu lassen. Filtern Sie den oberen Bruch durch einen 400 m Zellfilter in ein 50 ml Rohr.
Drehen Sie dann den Filter auf den Kopf über das Rohr und übertragen Sie die Adipozyten in ein neues Rohr mit 0,5%BSA, um den Filter umzukehren. Bringen Sie das Gesamtvolumen der BSA auf 10 bis 15 ml und pipette die Probe mit serologischer Pipette nach oben und unten. Dann zentrieren Sie es wieder bei 300 xg für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Nach der Zentrifugation verwenden Sie eine breitbohrungspipette Spitze, um die obere Schicht der Probe sorgfältig auf einen 100 m Zellfilter auf einem neuen vorgekühlten Rohr auf Eis zu übertragen. Spülen Sie den Filter mit einer ausreichenden Menge an Kernvorbereitungspuffer, und entsorgen Sie ihn dann. Von diesem Schritt vorwärts, halten Sie eine Probe auf Eis und arbeiten schnell.
Lassen Sie die Probe bis zu zwei Minuten zeitweilig auf Eis und invertieren Sie die Röhre zum Mischen. Dann Zentrifuge bei 1000 xg und 4 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml Kernvorbereitungspuffer wieder auf.
Übertragen Sie die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr, um zu vermeiden, dass die Wände des alten Rohres berührt werden. Fügen Sie 0,6 Einheiten pro L RNase-Hemmer hinzu und mischen Sie ihn. Zentrifugieren Sie die Probe dann für weitere 10 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ein Pellet und 1 ml Kernwaschpuffer wieder auf. Filtern Sie die Probe mit stapelbaren 30 m Filtern in ein Sauberes Rohr. Dann waschen Sie die Filter mit ca. 300 L Kernwaschpuffer.
Um die erfolgreiche Isolierung gesunder Kerne zu bestätigen, färben Sie ein kleines Aliquot der Probe mit Trypan und verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die durchschnittliche Totgröße und Prozent der abgestorbenen Zellen zu bewerten. Stain in einem kleinen Aliquot der Probe mit DAPI und untersuchen Sie es unter dem Mikroskop mit einem 20X Objektiv oder höher. Die Kerne sollten rund sein und eine intakte Kernmembran haben.
Weiße Pfeile zeigen Kerne ohne intakte Membran an. Nach dem Aufräumen der Kerne mit FACS, konzentrieren Sie diese Probe durch Zentrifugieren bei 500 xg für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius. Dann rekonstituieren Sie es in einem entsprechenden Volumen von Kernen Waschpuffer.
Um eine 50 bis 1500 Kerne pro L-Konzentration zu erreichen und mit einzelligen Kernen RNA seq fortzufahren. Um Zellablagerungen und Doublets zu entfernen, werden Adipozytenkerne nach Größe und Granularität sortiert, um kernnukleare Aggregate und Multiplets auszuschließen. Und schließlich für DAPI positive Ereignisse.
Diese Einstufungsstrategie führt zu hochgereinigten Einzelkernen mit minimalen Aggregaten und Ablagerungen. Bei der Mikroskopie sollten die sortierten Kerne rund sein und eine intakte Membran haben. Eine erfolgreiche Reinigung der Kerne kann auch mit Echtzeit-qRT-PCR mit Primern für entstehende Ucp1 mRNA, einem Markergen für braune Adipozyten, durchgeführt werden.
Die Chromplattform ermittelte ein Transkriptom von 7500 Kernen aus murinem interscapularem braunem Fettgewebe. Sieben verschiedene Zelltypen wurden mit t-SNE-Dimensionsreduktion und k-Mittel-Clustering aufgedeckt. Alle Cluster exprimierten Fabp4, ein Pan-Adipozyten-Gen und eine Teilmenge einen hohen Gehalt an Ucp1 mRNA.
Kerne isoliert und dann bestätigt, obwohl dieses Protokoll kann praktisch jede Single-Zell-Level-Gen-Expression-Plattform einschließlich Chrom von 10x Genomics unterzogen werden.
