Die Blut-Rückenmark-Schranke ist eng miteinander verbunden und hat eine begrenzte Durchlässigkeit. Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, die Blut-Rückenmark-Schranke mithilfe von Mikrobläschen und fokussiertem Ultraschall sicher und vorübergehend zu öffnen. Diese Technik ermöglicht es, die Öffnung der Blut-Rückenmark-Schranke auf das Zielsegment des Rückenmarks zu lokalisieren.
Darüber hinaus kann die Störung durch visuelle Beobachtung oder Fluoreszenzmikroskopie leicht bestätigt werden. Dieses Protokoll kann auf sein Potenzial zur Verbesserung der Verabreichung von Gentherapien oder Medikamenten an das Rückenmark zur Behandlung von Tumoren, Atrophie oder Verletzungen untersucht werden. Das Verfahren wird von Meghana Bhimreddy demonstriert.
Ein hervorragender Medizinstudent aus meinem Labor, der täglich die Brücke zwischen Technik und Medizin schlägt. Erwerben Sie zunächst ein fokussiertes Ultraschallwandlersystem mit Spezifikationen, die ausreichen, um eine Blut-Rückenmark-Schranke oder BSCB-Öffnungen bei Ratten zu erreichen. Befestigen Sie den 3D-gedruckten Sondenhalter und den Wasserkegel am Wandler.
Stellen Sie sicher, dass eine wasserdichte Abdichtung zwischen dem Konus und dem Wandler besteht. Befestigen Sie die sterilisierte, 50 Mikrometer dicke, akustisch transparente Polyestermembran mit einem Gummiband am Boden des Wasserkegels. Füllen Sie den Wasserkegel mit entgastem und deionisiertem Wasser über die Ein- und Auslassrohre.
Vermeiden Sie Luftblasen im Inneren der Membran, da diese die akustische Kopplung zwischen Wandler und Messobjekt stören können. In diesem Stadium sollte die Mylar-Membran leicht aufgeblasen werden. Schließen Sie die Antriebsausrüstung mit dem Wellengenerator und dem Hochfrequenzverstärker an den Wandler an.
Befestigen Sie den stereotaktischen Arm an der Fixierplatte und befestigen Sie den Sondenhalter am Arm. Zeichnen Sie das Gewicht einer betäubten Sprague-Dawley-Ratte auf und führen Sie einen Zehen- und Schwanzklemmtest durch, um die Anästhesie zu bestätigen. Legen Sie ein Heizkissen und ein steriles, saugfähiges Pad auf die Fixierplatte.
Positionieren Sie die Ratte auf der saugfähigen Unterlage. Tragen Sie Augensalbe auf und legen Sie ein rektales Thermometer auf, um die Körpertemperatur zu überwachen. Abtasten Sie die letzte Rippe der Ratte, die am 13. Brustwirbel an der Wirbelsäule befestigt ist.
Verwende einen elektrischen Rasierer, um das Fell von der Rückenfläche zwischen der letzten Rippe und dem Hals zu rasieren. Wischen Sie die freiliegende Haut mit Gaze ab, die in 10%iges Jodopovidon getaucht ist. Legen Sie mit einer Irisschere einen Mittellinienschnitt an und präparieren Sie durch die Faszie, bis die Dornfortsätze und die Lamina freiliegen.
Entfernen Sie den Knochen mit einer versetzten Knochenzange und einer Irisschere mit abgewinkelter Klinge, bis das Rückenmark freiliegt. Befestigen Sie die Ratte an der Fixationsplatte, indem Sie die Dornfortsätze neben der Laminektomie einklemmen. Ziehen Sie dann leicht an den Klammern, um die Wirbelsäule straff zu machen.
Passen Sie die Position des Schallkopfes mit dem stereotaktischen Arm an, bis er sich genau über der Laminektomie befindet. Befestigen Sie das Lasergerät an der Unterseite des Wasserkegels und senken Sie es ab, bis der Laserpunkt sichtbar ist. Passen Sie dann die seitliche Position des Wandlers an, bis sich der Laserpunkt über der Zielposition für die BSCB-Störung befindet.
Entfernen Sie das Lasergerät und füllen Sie den Raum zwischen Kegel und Rückenmark mit entgastem Ultraschallgel, ohne Luftblasen einzubringen. Stellen Sie die Parameter für die Beschallung am Leistungsausgang des Wandlers ein. Bereiten Sie eine Mikroblasenlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
Um die Chancen auf eine erfolgreiche Katheterisierung der Schwanzvene zu erhöhen, tauchen Sie den Schwanz in warmes Wasser und legen Sie ein Tourniquet an der Basis des Schwanzes, um den Venendurchmesser zu vergrößern. Führen Sie dann einen 22-Gauge-Schwanzvenenkatheter ein und spülen Sie ihn mit 0,2 Millilitern heparinisierter Kochsalzlösung. Injizieren Sie einen Milliliter pro Kilogramm 3%Evans Blue Dye oder EBD in den Katheter.
Spülen Sie dann den Katheter mit 0,2 Millilitern heparinisierter Kochsalzlösung. Bestätigen Sie die erfolgreiche Schwanzvenenkatheterisierung, indem Sie die Haut, die Augen oder die Rückenvene der Ratte auf eine blaue Farbveränderung überprüfen. Injizieren Sie 0,2 Milliliter Bolus Mikrobläschen in den Katheter und spülen Sie mit heparinisierter Kochsalzlösung, bevor Sie mit der Beschallung beginnen.
Nachdem Sie die Ratte eingeschläfert haben, entfernen Sie das Rückenmark und legen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in 4%iges Paraformaldehyd. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Paraformaldehyd durch PBS. Um die BSCB-Störung zu visualisieren, isolieren Sie mit einer Rasierklinge einen zwei Zentimeter langen Abschnitt um den Ort der Beschallung.
Teilen Sie den Abschnitt mit einem Mikrotom in 10 Mikrometer dicke Abschnitte auf und färben Sie ihn mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Für die Fluoreszenzmikroskopie wird der Objektträger, der den Rückenmarksabschnitt enthält, entparaffiniert und mit 25 Mikrolitern DAPI, das im Einbettmedium gelöst ist, gegengefärbt. Inkubieren Sie die Abschnitte bei vier Grad Celsius für 10 Minuten im Dunkeln, um ein Ausbleichen zu verhindern.
Verwenden Sie nach der Inkubation ein Fluoreszenzmikroskop, um alle Objektträger abzubilden. Bilden Sie den mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Objektträger mit einem Lichtmikroskop ab. Das Rückenmarksgefäßsystem ist nach der Laminektomie sichtbar und zeigt die hintere Spinalvene mit mehreren kleineren Gefäßen, die seitlich ausstrahlen.
Nach intravenöser Injektion von EBD erschienen das umliegende Gewebe und das Rückenmarksgefäßsystem blau. Nach der Beschallung wird ein blauer Fleck über der Zielstelle sichtbar, der auf die Extravasation von EBD in das weiße Parenchym aufgrund einer BSCB-Störung hinweist. Das herausgeschnittene Rückenmark der Ratten mit fokussiertem Ultraschall niedriger Intensität oder LIFU-Beschallung bestätigte eine offensichtliche Extravasation von EBD in das Rückenmark.
Während negativ kontrollierte Ratten ohne LIFU-Behandlung keine EBD-Extravasation zeigten. Rückenmark mit LIFU-Beschallung zeigte eine signifikant höhere Intensität der EBD-Autofluoreszenz als Stränge, die keine Beschallung erhielten. Mit ähnlichen Intensitäten von DAPI in beiden vorhanden.
Die Hämatoxylin- und Eosinanalyse ergab keine neuronalen Schäden, Blutungen oder Hohlraumläsionen an den beschallten Stellen. Beispiele für verletzte Nabelschnuren aufgrund von chirurgischer Fehlbehandlung und leistungsstarker Beschallung werden zum Vergleich gezeigt. Bei Ratten, die Mikrobläschen und eine LIFU-Behandlung erhielten, wurde keine Veränderung der motorischen Scores, der Beschallung vor und nach der Beschallung und während einer fünftägigen Überlebensphase beobachtet.
Minimale Veränderungen der Rückenmarkstemperatur wurden vor, während und nach der Beschallungsanalyse beobachtet. Es ist wichtig, die chirurgische Schädigung der Nabelschnur während der Laminektomie zu begrenzen. Die mikroskopische Visualisierung der H- und E-gefärbten Schnitte zeigt an, ob eine Beschädigung aufgetreten ist.
Nach einer Störung der Blut-Rückenmark-Schranke können den Tieren mittels Fokusultraschall antineoplastische Mittel oder Gentherapien injiziert werden. Das Ergebnis wird bestimmen, ob diese Technik die Verabreichung von Therapeutika verbessern und das Überleben bei Rückenmarkserkrankungen verlängern kann.
