Wir danken der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss Nr. 31800903, vergeben an W. Zheng) und dem Wenzhou Science and Technology Project (Nr. Y2020426, vergeben an Y. Y. Weng) für diese Arbeit.

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wenzhou Medical University genehmigt.
1. Tiere
<ol><li>Kaufen Sie männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und einem Gewicht von 20-22 g.</li>
	<li>Besorgen Sie sich die transgene Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) Mauslinie und männliche A2AR flox/flox Mäuse.</li>
	<li>Verteilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip auf zwei Gruppen und halten Sie sie 1 Woche lang in Käfigen mit maximal fünf Mäusen pro Käfig unter einem Standardzyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkel.</li>
	<li>Versorgen Sie die Mäuse mit ausreichend Futter und Wasser und halten Sie sie auf einer konstanten Temperatur von 25 °C.</li>
</ol>2. ChP-spezifischer Knockdown von A2ARs mit AAV2/5-shRNA
<ol><li>Wiegen Sie jede Maus und notieren Sie sich die Werte.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse intraperitoneal mit 1% Pentobarbital-Natrium in einer Dosierung von 6-8 ml/kg, was 60-80 mg/kg Pentobarbital entspricht, und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um sie warm zu halten. HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Dosierung von Pentobarbital-Natrium entsprechend dem Gewicht der Maus zu verabreichen, um eine erfolgreiche Operation zu gewährleisten. Die Anästhesie sollte nicht zu tief sein, da dies zur Sterblichkeit führen kann, aber auch nicht zu flach, da die Maus während des Eingriffs aufwachen und die Wirksamkeit der Virusinjektion beeinträchtigen könnte. Überprüfen Sie die richtige Anästhesiedosis, indem Sie die Zehen zusammenkneifen und sicherstellen, dass die Mäuse nicht ansprechen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen speziellen Mausrasierer, um die oberen Haare der betäubten Mäuse zu trimmen.</li>
	<li>Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern, und fixieren Sie die Mäuse auf einem stereotaktischen Apparat, um das Gehirn zu immobilisieren. Decken Sie das Tier mit einem sterilen Tuch ab.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Haut von Kopf und Hals der Mäuse gründlich mit drei Runden Jodophor-Desinfektionsmittel und 75%igem Alkohol, um die postoperative Infektion zu reduzieren. Tragen Sie dann 1% Lidocain topisch auf die Kopfhaut von Mäusen auf und machen Sie einen kleinen Schnitt, um den Schädel unter einem Mikroskop vollständig freizulegen. HINWEIS: Verwenden Sie während des gesamten Eingriffs sterile Instrumente.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei 10-μl-Spritzen vor: eine mit gekaufter AAV2/5-A 2A R-shRNA (Titer: 6,27 × 10 9 vg/μl) und die andere mit gekauftem AAV2/5-Scramble (Titer:6,21× 109 vg/μl). HINWEIS: Bei Verwendung der Spritze muss das vordere Ende an eine Glaskapillare angeschlossen werden, und ein Bereich von 10 μl kann durch Steuerung der Länge der Glaskapillare erreicht werden.</li>
	<li>Verwenden Sie das Mikroskop, um das Bregma und das Lambda zu lokalisieren und den Koordinatenpunkt einzustellen (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2,20) auf der 10-μl-Spritze (Abbildung 1). Der Koordinatenpunkt basiert auf dem stereotaktischen Atlas15 des Mäusegehirns.</li>
	<li>Bohren Sie am angepassten Koordinatenpunkt ein kleines Loch in den Schädel. HINWEIS: Unter dem Mikroskop wird mit einem sterilen Mikrobohrer gegen die Oberfläche des Schädels gebohrt. Nach dem Bohren wird durch die Entfernung der Hirnhäute, die das Gehirn bedecken, und die Freilegung des darunter liegenden Hirnparenchyms eine Verletzung der Blutgefäße verhindert. Dieser Schritt verhindert, dass die Spitze der Glaskapillare durch die Hirnhäute abgebrochen wird. Der Durchmesser des Bohrlochs sollte ausreichend sein, damit die Nadelspitze in das Hirngewebe eindringen kann.</li>
	<li>Verabreichung von 2 μl AAV2/5-A2AR-shRNA-Virus in die Hirnkammer durch laterale Injektion mit einer konstanten Rate von 100 nL/min. Halten Sie die Nadel 10 Minuten lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie zurückziehen. Beachten Sie, dass das Virus mit einseitiger Injektion verabreicht wurde.</li>
	<li>Versiegeln Sie die verletzte Haut umgehend mit medizinischem Biofibrin-Kleber, um Virusverlust zu verhindern, der nach dem Entfernen der Nadel mit Liquor ausgespült werden kann, wenn der Kleber nicht schnell aufgetragen wird. Verwenden Sie auch keine Wattestäbchen, um den Liquor abzuwischen, da dies ebenfalls zu Virenverlust führen kann.</li>
	<li>Um die Regeneration zu erleichtern, legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur bei 37,0 ± 0,5 °C zu halten, und tragen Sie 1% Lidocain topisch auf die Kopfhaut der Maus auf. Lassen Sie die Mäuse 2 Wochen lang erholen, bevor Sie das EAE-Modell induzieren, da dieser Zeitraum für die Expression des AAV2/5-A 2A R-shRNA-Virus und den anschließenden A2AR-Knockdown erforderlich ist.</li>
</ol>3. ChP-spezifischer Knockdown von A2AR mit einem Cre/Locus von X-overP1 (Cre/LoxP) System
HINWEIS: Die folgenden Verfahren können mit der zuvor beschriebenen Methode erreicht werden. In den Schritten 2.1 bis 2.11 finden Sie detaillierte Informationen zu den Injektionsmethoden.
<ol><li>Injizieren Sie 2 μl CRE-TAT-Rekombinase in jeden Seitenventrikel einer Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato-Maus als Versuchsgruppe und 2 μl sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) als Kontrollgruppe. Unter Verwendung des gleichen Protokolls wie oben (Abschnitt 2) werden 2 μl CRE-TAT-Rekombinase in jeden der lateralen Ventrikel von A2AR-Flox/Flox-Mäusen zusammen mit 2 μl sterilem PBS als Kontrollgruppe injiziert.</li>
	<li>Bereiten Sie gefrorene Gewebeschnitte vor und führen Sie 2 Wochen nach der CRE-TAT-Rekombinase-Injektion eine Kernfärbung durch. Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 4.1 bis 4.3.</li>
</ol>4. Transkardiale Perfusion bei Mäusen
<ol><li>Verabreichen Sie 60-80 mg/kg Pentobarbital-Natrium, um die Mäuse tief zu betäuben. Bestätigen Sie die Anästhesieebene durch eine Zehenkneifung und führen Sie eine transkardiale Perfusion mit 40 ml steriler PBS-Lösung gefolgt von 20 ml 4%igem Paraformaldehyd (PFA) durch. HINWEIS: Eine erfolgreiche Perfusion wird durch eine weiße Farbe in der Leber angezeigt, während das Vorhandensein einer vergrößerten Lunge oder eines PBS-Abflusses aus dem Mund während der Perfusion auf ein Versagen des Verfahrens hindeutet.</li>
	<li>Schnelles Extrahieren des Mäusegehirns, um einen minimalen Proteinabbau zu gewährleisten.</li>
	<li>Tauchen Sie das Mäusegehirn über Nacht zur Nachfixierung in 4 % PFA/PBS ein, gefolgt von einem Ersatz durch 30 % Saccharose-PB-Lösung für 72 Stunden. HINWEIS: Es ist wichtig, eine übermäßige Dehydrierung des Hirngewebes zu vermeiden, daher sollte das Gehirn nicht zu lange in der Saccharose-PB-Lösung belassen werden.</li>
</ol>5. Schneiden und Färben von gefrorenem Gewebe
<ol><li>Betten Sie das zuvor dehydrierte Mäusegehirn in OCT-Kleber (Optimum Cutting Temperature) ein, frieren Sie das eingebettete Gehirn ein und schneiden Sie mit einem gleitenden Mikrotom koronale Schnitte mit einer Dicke von 20 μm.</li>
	<li>Legen Sie die Hirnabschnitte auf den Objektträger. Sobald die Hirnabschnitte getrocknet sind, lagern Sie sie für nachfolgende Experimente in einem -20 °C heißen Kühlschrank.</li>
	<li>Legen Sie jeden Objektträger in ein Rahmengehäuse und tauchen Sie den Rahmen in einen mit PBS gefüllten Behälter, um den Objektträger gründlich abzuspülen. Spülen Sie die Objektträger dreimal vorsichtig mit PBS-Lösung ab, jeweils 10 Minuten lang. HINWEIS: Es ist Vorsicht geboten, um zu verhindern, dass die Hirnabschnitte vom Objektträger fallen.</li>
	<li>Färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung.</li>
	<li>Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit PBS-Lösung.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen Antifade-Eindeckmittel auf die Gehirnabschnitte auf.</li>
	<li>Legen Sie ein Deckglas auf die Hirnschnitte, versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack und analysieren Sie die Schnitte mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>6. EAE-Induktion
HINWEIS: Führen Sie die EAE-Induktion nach 2 Wochen der shRNA- oder CRE-TAT-Rekombinase-Injektiondurch 11.
<ol><li>Stellen Sie eine wässrige Lösung her, indem Sie 2,5 mg Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) mit 2 ml PBS mischen. Bereiten Sie eine vollständige Freunds-Adjuvans-Öllösung (CFA) vor, indem Sie M. tuberculosis (H37Ra) mit unvollständigem Freunds-Adjuvans (IFA) mischen.</li>
	<li>Mischen Sie die wässrige und die Öllösung im Verhältnis 1:1. Verwende ein T-Rohr, um die Mischung in einen Öl-in-Wasser-Zustand zu bringen. HINWEIS: Das T-Rohr wird auch als Dreiwegerohr bezeichnet. Es handelt sich um ein Kunststoffrohr, das die Richtung der fließenden Lösung steuern kann, um MOG35-55 und CFA vollständig zu mischen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Homogenisator, um die MOG-Antigen-Emulsion für das EAE-Modell unter Eisbadbedingungen herzustellen.</li>
	<li>Die Mäuse werden intraperitoneal mit 1% Pentobarbital-Natrium in einer Dosierung von 6-8 ml/kg entsprechend 60-80 mg/kg Pentobarbital anästhesiert.</li>
	<li>Subkutan injizieren Sie die MOG-Antigen-Emulsion in vier verschiedene Punkte (Nacken, Rücken, linke und rechte Hüfte) in einem Volumen von 10 ml/kg für jeweils vier Injektionen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Injektionsstelle sorgfältig auszuwählen, da verschiedene Stellen unterschiedliche Auswirkungen auf die Morbidität und Mortalität von Mäusen haben können. Darüber hinaus können wiederholte MOG-Injektionen zu einer Immuntoleranz führen, so dass das Forschungsteam eine einzige Injektionsmethode wählte, um dieses potenzielle Problem zu verhindern.</li>
	<li>Nach der MOG-Injektion werden sofort 500 ng/ml Pertussistoxin (PT) intraperitoneal in einer Dosierung von 5 mg/kg injiziert. HINWEIS: PT erhöht die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und erleichtert die Infiltration von T-Zellen in das Gehirn.</li>
	<li>Nach 48 h wird die PT-Lösung im gleichen Volumen intraperitoneal injiziert.</li>
</ol>7. Neurologischer Defizit-Score
<ol><li>Bewerten und bewerten Sie die Mäuse täglich anhand einer Bewertungsskala16 von 0 bis 15, um die Inzidenz und den Schweregrad von EAE anhand der folgenden neurologischen Defizite zu beurteilen: Schwanz: 0 zeigt keine Anzeichen an, 1 steht für einen halb gelähmten Schwanz und 2 für einen vollständig gelähmten Schwanz. Gliedmaßen: 0 steht für keine Anzeichen, 1 für einen schwachen oder veränderten Gang, 2 für Parese und 3 für eine vollständig gelähmte Gliedmaße.</li>
	<li>Weisen Sie einem querschnittsgelähmten Tier mit vollständiger Lähmung einen Wert von 12 zu und weisen Sie der Mortalität einen Wert von 15 zu.</li>
</ol>8. Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung
<ol><li>Nimm das dehydrierte Mäusegehirn und bette es in geschmolzenes Paraffin ein. Lassen Sie den Paraffinblock abkühlen und für die spätere Verwendung fest werden. HINWEIS: Der Paraffinblock sollte vollständig trocken und kühl sein, um Gewebeschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Schneiden Sie den Paraffinblock für das Mäusegehirn in 5 μm dicke Objektträger. Den Paraffin-Mäuse-Hirnschnitt auf einen Objektträger legen und im 60 °C heißen Ofen 3 h trocknen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Objektträger nacheinander für 10 Minuten in Xylollösung I, Xylollösung II für 10 Minuten, 100% Alkohol I für 3 Minuten, 100% Alkohol II für 3 Minuten, 95% Alkohol für 3 Minuten, 90% Alkohol für 3 Minuten, 80% Alkohol für 3 Minuten, 70% Alkohol für 3 Minuten und destilliertes Wasser für 1 Minute.</li>
</ol>9. Quantitative Analyse der Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
<ol><li>Nachdem Sie die Mäuse mit PBS durchblutet haben, entfernen Sie das ChP aus den Ventrikeln und extrahieren Sie die RNA mit Trizol. Synthetisieren Sie die cDNA mit dem ersten Strang-cDNA-Synthesekit.</li>
	<li>Führen Sie die qPCR-Analyse mit Ex Taq SYBR-green Premix und einem Real-Time-PCR-System durch. Verwenden Sie die folgenden A2AR-Primer: vorwärts - GCCATCCCATTCGCCATCA; umgekehrt - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Selektives Gen-Silencing im Plexus choroideus

<ol>
	<li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus.">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. 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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Offenlegungen zu deklarieren haben.

In der Studie wurden zwei unterschiedliche Ansätze für den gezielten Knockdown von ChP-Genen vorgestellt. Der erste Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von CRE-TAT, das Cre-Rekombinase enthält, in A2AR-Flox/Flox-Mäuse. Der zweite Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von AAV2/5, das shRNA von A2AR trägt. Durch die Verwendung dieser beiden Strategien gelang es der selektiven Knockdown von A 2A R innerhalb der ChP und konnte die schützende Wirkung der Hemmung des A2AR-Signa...

Es wurde oft angenommen, dass der Plexus choroideus (ChP) zur Aufrechterhaltung der funktionellen Homöostase des Gehirns beiträgt, indem er Liquor cerebrospinalis (CSF) und den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) sezerniert1,2. Zunehmende Forschung in den letzten drei Jahrzehnten hat gezeigt, dass das ChP einen eindeutigen Weg für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) darstellt.
Die Tight Junctions (TJs) des ChP, die aus einem monoschichtigen ChP-Epithel bestehen, halten die immunologische Homöostase aufrecht, indem sie verhindern, dass Makromoleküle und Immunzellen in das Gehirn eindringen3. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen erkennt und reagiert das ChP-Gewebe jedoch auf gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) im Liquor und im Blut, was zu einer abnormalen Immuninfiltration und einer Dysfunktion des Gehirns führt 4,5. Trotz seiner entscheidenden Rolle machen es die geringe Größe und die einzigartige Lage des ChP im Gehirn schwierig, seine Funktion zu untersuchen, ohne andere Gehirnregionen zu beeinträchtigen. Daher ist die spezifische Manipulation der Genexpression im ChP ein idealer Ansatz, um seine Funktion zu verstehen.
Ursprünglich wurden transgene Linien von Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre), die Cre unter der Kontrolle von Promotoren exprimieren, die für Gene spezifisch sind, die in der ChP exprimiert werden, verwendet, um Zielgene durch Züchtung mit floxierten Kandidatengenen zu löschen 6,7,8. Zum Beispiel wird der Transkriptionsfaktor Forkhead box J1 (FoxJ1) ausschließlich im ChP-Epithel des pränatalen Mäusegehirns exprimiert7. So wurde die FoxJ1-Cre-Linie häufig verwendet, um Gene zu löschen, die sich im ChP 6,9 befinden. Der Erfolg dieser Strategie hängt jedoch stark von der Spezifität des Projektträgers ab. Nach und nach wurde entdeckt, dass das FoxJ1-Expressionsmuster nicht ausgeprägt genug war, da FoxJ1 auch in Flimmerepithelzellen in anderen Teilen des Gehirns und des peripheren Systems vorhanden war7. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von Cre-Rekombinase durchgeführt, um Rekombinase in die Ventrikel von gefloxten transgenen Linien zu bringen. Diese Strategie zeigte eine hohe Spezifität, was durch das Vorhandensein von tdTomato-Fluoreszenz allein im ChP-Gewebe belegtwird 10,11. Diese Methode ist jedoch noch durch die Verfügbarkeit von floxierten transgenen Mauslinien begrenzt. Um dieses Problem anzugehen, haben Forscher die ICV-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) eingesetzt, um einen ChP-spezifischen Knockdown oder die Überexpression von Zielgenen zu erreichen12,13. Eine umfassende Untersuchung verschiedener AAV-Serotypen für eine ChP-Infektion ergab, dass AAV2/5 und AAV2/8 starke Infektionsfähigkeiten in der ChP aufweisen, während sie andere Hirnregionen nicht infizieren. Es wurde jedoch festgestellt, dass AAV2/8 das Ependym um die Ventrikel herum infizierte, während die AAV2/5-Gruppe keine Infektion aufwies14. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie die Einschränkungen beim Erwerb von transgenen Tieren überwindet.
Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Gen-Knockdown im ChP mit zwei Methoden: ICV von AAV2/5, das shRNA des Adenosin-A2A-Rezeptors (A 2A R) trägt, und Cre-Rekombinase-Protein, das aus einer TAT-Sequenz (CRE-TAT)-Rekombinase besteht, um einen ChP-spezifischen Knockdown von A2A R zu erreichen. Die Studienergebnisse deuten darauf hin, dass der Abbau von A2AR in der ChP die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) lindern kann. Dieses detaillierte Protokoll bietet nützliche Hinweise für ChP-Funktionsstudien und den spezifischen Knockdown von Genen im ChP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2ARflox/flox mice</td>
			<td>State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2/5-A2AR-ShRNA virus</td>
			<td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td>
			<td>pt-4828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antifade mounting medium</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary</td>
			<td>Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD, Shenzhen</td>
			<td>69100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRE-TAT recombinase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Absin</td>
			<td>B25A031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen slicing machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra</td>
			<td>Becton Dickinson and company</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, American</td>
			<td>P/N:&#160;86259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freunds adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55</td>
			<td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>4010006243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT glue</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>6502p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Boyun Biotech</td>
			<td>PC13003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N45014F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>&#160;6110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real- Time PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>CFX96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>super high speed homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene solution</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted knockdown of genes in the choroid plexus

Der Plexus choroideus (ChP) dient sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als kritisches Einfallstor für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS). Neuere Forschungen haben gezeigt, dass die Regulierung der ChP-Aktivität Schutz vor ZNS-Erkrankungen bieten kann. Die biologische Funktion des ChP zu untersuchen, ohne andere Hirnregionen zu beeinträchtigen, ist jedoch aufgrund seiner empfindlichen Struktur eine Herausforderung. In dieser Arbeit wird eine neue Methode zum Gen-Knockdown in ChP-Gewebe unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAVs) oder Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre)-Rekombinase-Proteinen, bestehend aus TAT-Sequenzen (CRE-TAT), vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass nach der Injektion von AAV oder CRE-TAT in den lateralen Ventrikel die Fluoreszenz ausschließlich im ChP konzentriert war. Mit diesem Ansatz gelang es in der Studie, den Adenosin-A2A-Rezeptor (A2A R) im ChP mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) oder Cre/Locus von X-overP1 (Cre/LoxP)-Systemen auszuschalten, und zeigte, dass dieser Knockdown die Pathologie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) lindern könnte. Diese Technik könnte wichtige Implikationen für die zukünftige Forschung über die Rolle des ChP bei ZNS-Erkrankungen haben.

The choroid plexus (ChP) was often thought to help maintain brain functional homeostasis by secreting cerebrospinal fluid (CSF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF)1,2. Increasing research over the last three decades has revealed that the ChP represents a distinct pathway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS).
The tight junctions (TJs) of the ChP, composed of a monolayer ChP epithelium, maintain immunological homeostasis by preventing macromolecules and immune cells from entering the brain3. However, under certain pathological conditions, the ChP tissue detects and responds to danger-associated molecular patterns (DAMPs) in the CSF and blood, leading to abnormal immune infiltration and brain dysfunction4,5. Despite its critical role, the ChP&#39;s small size and unique location in the brain make it difficult to study its function without affecting other brain regions. Therefore, manipulating gene expression specifically in the ChP is an ideal approach to understanding its function.
Initially, cyclization recombination enzyme (Cre) transgenic lines, which express Cre under the control of promoters specific to genes expressed in the ChP, were commonly used to delete target genes by breeding with floxed candidate genes6,7,8. For example, the transcription factor Forkhead box J1 (FoxJ1) is exclusively expressed in the ChP epithelium of the prenatal mouse brain7. Thus, the FoxJ1-Cre line was often used to delete genes located in the ChP6,9. However, the success of this strategy relies heavily on the specificity of the promoter. It was gradually discovered that the FoxJ1 expression pattern was not distinctive enough, as FoxJ1 was also present in ciliated epithelial cells in other parts of the brain and peripheral system7. To overcome this limitation, intra-cerebroventricular (ICV) injection of Cre recombinase was performed to deliver recombinase into the ventricles of floxed transgenic lines. This strategy showed high specificity, as evidenced by the presence of tdTomato fluorescence solely in the ChP tissue10,11. However, this method is still limited by the availability of floxed transgenic mouse lines. To address this issue, researchers have employed ICV injection of adeno-associated virus (AAV) to achieve ChP-specific knockdown or the overexpression of target genes12,13. A comprehensive evaluation of different AAV serotypes for ChP infection revealed that AAV2/5 and AAV2/8 exhibit strong infection abilities in the ChP, while not infecting other brain regions. However, AAV2/8 was found to infect the ependyma surrounding ventricles, whereas the AAV2/5 group showed no infection14. This method has the advantage of overcoming the limitations of acquiring floxed transgenic animals.
This article describes a step-by-step protocol for gene knockdown in the ChP using two methods: ICV of AAV2/5 carrying shRNA of the adenosine A2A receptor (A2AR) and Cre recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT) recombinase to achieve ChP-specific knockdown of A2AR. The study findings suggest that knocking down A2AR in the ChP can alleviate experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This detailed protocol provides useful guidance for ChP function studies and the specific knockdown of genes in the ChP.

Autor im Rampenlicht: Erkenntnisse und Innovationen bei Techniken zur Manipulation der Genexpression für die Erforschung des Plexus choroideus 

Gezielter Knockdown von Genen im Plexus aderoid

The objective of this research is to investigate the techniques for manipulating gene expression in the choroid plexus. Our study has introduced the two methods that allow for technique exclusively in the choroid plexus without any discernible impact on other regions. Our findings can potentially enhance future function studies of the choroid plexus in neuroscience.Our research has reviewed that inhibiting T-cell infiltration across the choroid plexus through selective lockdown of adenosine to a receptor is sufficient to protect mice from EAE pathology. This finding supports the notion that detecting gateway activity in the choroid plexus could present a promising new strategy for treating multiple sclerosis. This study presents two alternative methods for gene expression manipulation in the choroid plexus.ICV injection of Cre recombinase into those transgenic mice or ICV injection of AAV2/5, or it's targeted SHI in the WT mice. These methods overcome issues with promoting specificity and transgenetic mouse breeding.

ChP-spezifischerA2AR-Knockdown durch ICV-Injektion von AAV2/5-shRNA oder CRE-TAT Die Rolle von A2AR in der ChP als mächtiger Regulator neuronaler Information in der EAE-Pathogenese bleibt unklar. Das Ausschalten der ChP-spezifischen A 2A R-Expression könnte Aufschluss über die regulatorischen Auswirkungen von A2AR auf das zentrale Immunsystem bei EAE und anderen Entzündungen des Nervensystems geben. In dieser Studie wurde die ICV-Injektion von CRE-TAT ve...

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Hier beschreiben wir eine Methode, um die Genexpression im Plexus choroideus selektiv zu verändern und gleichzeitig Auswirkungen auf andere Hirnareale zu vermeiden.

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

Das Ziel dieser Forschung ist es, die Techniken zur Manipulation der Genexpression im Plexus choroideus zu untersuchen. Unsere Studie hat die beiden Methoden vorgestellt, die eine Technik ausschließlich im Plexus choroideus ohne erkennbare Auswirkungen auf andere Regionen ermöglichen. Unsere Ergebnisse können möglicherweise zukünftige Funktionsstudien des Plexus choroideus in den Neurowissenschaften verbessern.Unsere Forschung hat gezeigt, dass die Hemmung der T-Zell-Infiltration über den Aderhautplexus durch selektiven Lockdown von Adenosin an einen Rezeptor ausreicht, um Mäuse vor der EAE-Pathologie zu schützen. Dieser Befund stützt die Vorstellung, dass der Nachweis der Gateway-Aktivität im Plexus choroideus eine vielversprechende neue Strategie zur Behandlung von Multipler Sklerose darstellen könnte. In dieser Studie werden zwei alternative Methoden zur Manipulation der Genexpression im Plexus choroideus vorgestellt.ICV-Injektion von Cre-Rekombinase in diese transgenen Mäuse oder ICV-Injektion von AAV2/5 oder gezielte SHI in den WT-Mäusen. Diese Methoden überwinden Probleme bei der Förderung der Spezifität und der transgenetischen Mauszucht.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

687 Aufrufe.  Wenzhou Medical University. Das Ziel dieser Forschung ist es, die Techniken zur Manipulation der Genexpression im Plexus choroideus zu untersuchen. Unsere Studie hat die beiden Methoden vorgestellt, die eine Technik ausschließlich im Plexus choroideus ohne erkennbare Auswirkungen auf andere Regionen ermöglichen. Unsere Ergebnisse können möglicherweise zukünftige Funktionsstudien des Plexus choroideus in den Neurowissenschaften verbessern.Unsere Forschung hat gezeigt, dass die Hemmung der T-Zell-Infiltration ...

Serie: Autor im Rampenlicht: Erkenntnisse und Innovationen bei Techniken zur Manipulation der Genexpression für die Erforschung des Plexus choroideus 

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

Forschung

Neurowissenschaften

ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System

ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System  

To begin, place the anesthetized mice on the surgical platform. After trimming the hair, apply eye ointment down both eyes to prevent them from drying. Then fix the mice onto a stereotaxic apparatus for immobilization.Make a small incision under a microscope to fully expose the skull. Prepare two 10 microliter syringes, one containing AAV2/5-adenosine 2A receptor shRNA, and the other containing AAV2/5 scramble. Then use the microscope to locate the bregma and lambda and set the coordinate point on the 10 microliter syringe based on the mouse brain stereotaxic atlas.Drill a small hole in the skull at the established coordinate point. Inject two microliters of AAV2/5-Adenosine 2A receptor shRNA virus into the brain ventricle via lateral injection at a steady rate of 100 nanoliters per minute. Keep the needle in place for 10 minutes before withdrawing.Seal the injured skin promptly using medical bio fibrin glue to prevent virus loss. Place the mouse on a heating pad, maintaining its body temperature approximately at 37 degrees Celsius to facilitate recovery. Inject two microliters of CRE-TAT Recombinase into each lateral ventricle of Arosa L-D-L-T-D tomato mouse for the experimental group, and two microliters of sterile PBS for the control group.Two weeks after the CRE-TAT Recombinase injection, prepare frozen tissue sections, perform nuclear staining and prepare the slide for imaging Knocking down adenosine 2A receptor in the choroid plexus in homozygous adenosine 2A receptor fluxed mouse, using CRE-TAT, led to decreased EAE clinical scores. Similarly, knocking down choroid plexus in adenosine 2A receptor wild-type mice, using AAV2/5 shRNA decreased EAE clinical scores. The QPCR analysis showed that the mRNA levels of adenosine 2A receptor decreased in the AAV2/5 shRNA and CRE-TAT groups, compared to each control.Silencing adenosine 2A receptor, specifically in the choroid plexus, reduced immune cell infiltration into the spinal cord.