Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Differenzierung von braunen Adipozyten, die wichtige adipogene Transkriptionsfaktoren und reife Adipozytenmarker exprimieren und das thermogene Potenzial und den morphologischen Phänotyp reifer brauner Adipozyten aufweisen. Dabei handelt es sich um ein einfaches und replizierbares zweiphasiges Differenzierungsverfahren, um Zellen mit Eigenschaften reifer brauner Adipozyten aus interscapularem braunem Fettgewebe neugeborener Mäuse zu gewinnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Aktivierungsmechanismen des braunen Fettgewebes als Ziel für die Behandlung von Fettleibigkeit.
Es war ein Modell für die Bestimmung der Mechanismen, die an der Pathophysiologie der Lipodystrophie beteiligt sind. Es wird erwartet, dass es eine Herausforderung sein wird, diese Technik zum ersten Mal durchzuführen. Es ist wichtig, ein detailliertes Protokoll zu haben und kritische Punkte hervorzuheben, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen.
Zu Beginn bringen Sie die eingeschläferte Maus in Bauchlage und machen Sie mit einer scharfen Schere einen einen Zentimeter langen Hautschnitt in der Mitte des Rückens des Tieres. Entfernen Sie vorsichtig die Haut, lösen Sie das iBAT mit einer kleinen Schere operativ vom Kadaver. Ernten Sie beide iBAT-Lappen mit einer Kurvenzange, um die Lappen unabhängig voneinander zu entfernen.
Legen Sie die beiden Lappen in ein Kunststoffröhrchen mit 1,5 Millilitern sterilem PBS bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie das iBAT-Gewebe 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Kollagenase-Typ-2-Verdauungspuffer mit kontinuierlichem sanftem Schütteln bei 800 U/min. Unterbrechen Sie mechanisch die Gewebesuspension im Kollagenase-Typ-2-Verdauungspuffer, indem Sie mit einer P1000-Mikropipette und Filterspitzen auf und ab pipettieren.
Verwenden Sie für jede Probe eine neue Spitze. Führen Sie das entsegregierte Gewebe durch einzelne 100-Mikrometer-Zellsiebe in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter ACK-Puffer zu den gefilterten Gewebeproben.
Die Röhrchen vier- bis fünfmal umdrehen und vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend werden die Suspensionen mit einer P1000-Mikropipette und filtrierten Spitzen durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen geleitet. Durch Zentrifusion wird das Pellet wie im Textmanuskript beschrieben resuspendiert.
Säen Sie dann jede Probe in sechs Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte aus, indem Sie jeweils einen Milliliter der Suspension in jede Vertiefung geben. Die undifferenzierten Präadipozyten wiesen sehr niedrige oder nicht nachweisbare Spiegel von ppar-gamma, C/ebp-alpha, Perilipin 1 und CD36 auf. Im Gegensatz dazu waren diese Marker am siebten Tag der Differenzierung signifikant höher.
Die Akkumulation mehrerer Lipidtröpfchen in den braunen Präadipozyten stimmte mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen überein. Ein signifikanter Anstieg des mitochondrialen Massenmarkers TOM 20 und des Proteinspiegels des oxidativen Phosphorylierungskomplexes wurde am siebten Tag der Differenzierung beobachtet. UCP1, ein bonafide-Marker dieses Zelltyps, wurde in undifferenzierten Präadipozyten nicht nachgewiesen, während er in reifen braunen Adipozyten am siebten Tag der Differenzierung im Wesentlichen exprimiert wurde.
Die Mitochondrien entwickelten sich von einer länglichen, röhrenförmigen Form am Tag Null zu einer abgerundeten oder bohnenartigen Form am siebten Tag. Die mitochondriale innere Struktur wurde ebenfalls durch Adipogenese verändert, was zu einer höheren Dichte der parallel gepackten Kristalle führte. Wichtig ist, dass die Mitochondrien eng mit den Lipidtröpfchen in den differenzierten braunen Adipozyten verbunden waren, so dass selbst mit hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie kein erkennbarer Abstand zwischen der äußeren Membran der Mitochondrien und den Oberflächen der Lipidtröpfchen nachgewiesen werden konnte.
Die chirurgische Entfernung von interscapulärem Fettgewebe ist von entscheidender Bedeutung. Eine ineffiziente Menge an Gewebe schränkt die Verfügbarkeit von Zellen ein, die differenziert werden sollen. Dieses bildgebende Verfahren hilft bei der Charakterisierung der Morphologie differenzierter brauner Adipozyten in vitro.
Es ist möglich, Assays für die mitochondriale Funktion, die beta-androgene Aktivierung und die autophagische Hemmung durchzuführen.
