Die Autoren erkennen an, dass das Land, an dem sie diese Forschung durchgeführt haben, das traditionelle, angestammte und nicht abgetretene Territorium der xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Nation ist. Das Land, auf dem es sich befindet, war schon immer ein Ort des Lernens für das Volk der Musqueam, das seit Jahrtausenden seine Kultur, Geschichte und Traditionen an diesem Ort von einer Generation zur nächsten weitergegeben hat. Wir ermutigen andere, mehr über die Heimatländer zu erfahren, in denen sie bei https://native-land.ca leben und arbeiten. Die Autoren danken der Unterstützung durch die Canadian Graduate Scholarships - Master (N.P.), den Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, an MH), das Discovery Grants Program des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RGPIN-2019-04591 bis C.T., RGPIN-2016-04282 bis LCO), das Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, an C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, an C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 an LCO) und die Canadian Foundation for Innovation (34673 an LCO und 38277 an CT). Wir sind dankbar für die technische Unterstützung durch das UBC Centre for Disease Modelling und ubcFLOW, das von der UBC GREx Biological Resilience Initiative unterstützt wird, sowie für die Mitglieder der Labore Osborne und Tropini für kritische Diskussionen und die Bewertung des Manuskripts. Abbildung 1A und Abbildung 2A wurden mit Biorender.com erstellt.

Erforschung der Dynamik von Phagen-Bakterien im Darm in Mausmodellen unter Verwendung von T4-Phagen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Untersuchung von Phagen im Mikrobiom stellt im Vergleich zu ihren bakteriellen Gegenstücken eine große Herausforderung dar. Insbesondere enthalten Phagen keinen konservierten phylogenetischen Marker, der allen Phagen gemeinsam ist, ähnlich den ribosomalen 16S- und 18S-Untereinheiten, die die Sequenzierung und Identifizierung von prokaryotischen bzw. eukaryotischen Spezies erleichtern42. Mit den Fortschritten bei den Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation, einschließlich der Erhö...

Bakteriophagen oder Phagen sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und abtöten1. Phagen spielen eine wichtige Rolle in komplexen Bakteriengemeinschaften wie der Darmmikrobiota, wo sie an der Regulierung der Populationsdynamik und der Förderung der bakteriellen Fitness beteiligt sind2. In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung aufgrund des Aufkommens antimikrobiell resistenter Krankheitserreger3 und des Potenzials der Phagentherapie als alternative Behandlungsstrategie wieder gestiegen. In den letzten Jahren wurden lytische Phagencocktails mit einigem Erfolg bei schweren, antibiotikaresistenten bakteriellen septischen Infektionen beim Menschen intravenös eingesetzt 3,4. Die orale Phagentherapie wurde auch als potenzielle Alternative zu Antibiotika zur Behandlung von Darminfektionen und Entzündungen vorgeschlagen. Darüber hinaus wurden Phagen mit dem Erfolg von fäkalen Filtrattransplantationen (FFT) in Verbindung gebracht, bei denen es sich um fäkale Mikrobiota-Präparate handelt, die gefiltert wurden, um Bakterien zu entfernen, bei der Behandlung von rezidivierenden Clostridioides difficile-Infektionen (rCDI)5,6, entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)7,8 und nekrotisierender Enterokolitis bei Frühgeborenen9. Angesichts dieser Ergebnisse ist es wichtig, Wechselwirkungen sowohl zwischen Phagen und der Darmmikrobiota als auch zwischen Phagen und dem Säugetierwirt zu berücksichtigen, da die Hinzufügung neuer Phagen in eine bereits bestehende Gemeinschaft indirekte Auswirkungen auf die Gemeinschaft als Ganzes und nicht nur auf ihre Zielbakterien haben kann 2,10.
Die Untersuchung von Phageninteraktionen mit ihren Zielbakterien in vitro hat sich als nützlich erwiesen, um die Mechanismen und Auswirkungen von Phagen- und Bakterieninteraktionen im Darm zu verstehen. In diesem Setting wurde gezeigt, dass Escherichia coli-spezifische T4-Phagen der Ordnung Caudovirales Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domänen benötigen, die sich in hochantigenen äußeren Kapsidproteinen (Hoc) auf der Virionoberfläche befinden, um am Darmschleimzu haften 11. Darüber hinaus haben Transwell-Assays gezeigt, dass T4-Phagen in der Lage sind, mit Epithelzellkulturen zu interagieren und durch Makropinozytose durch Zellschichten zu translozieren12,13. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Phagen mit ihrem metazoischen Wirt interagieren können, obwohl sie nicht in der Lage sind, eukaryotische Zellen zu infizieren. Diese Modelle sind zwar nützlich, aber es fehlt ihnen die gesamte Bandbreite komplexer Interaktionen, die in einem Darmökosystem auftreten und für eine umfassende Untersuchung der dreigliedrigen Interaktion zwischen Phagen, Bakterien und dem Metazoenwirt erforderlich sind.
Mausmodelle sind ein wichtiges Werkzeug, um Phagen in komplexen Umgebungen zu untersuchen. Eine wünschenswerte Anwendung der Phagenverabreichung ist eine alternative Strategie zur Behandlung von antibiotikaresistenten Infektionen oder Pathobionten, die mit chronischen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich CED, assoziiert sind. Neue Literatur deutet jedoch darauf hin, dass das Verhalten von Phagen in vitro die Funktionen in vivo nicht vollständig abbildet. Buttimer et al.14 zeigten, dass ein Phagencocktail in der Lage war, die Zielbakterien in einem vereinfachten menschlichen Mikrobiota-Konsortium in vitro zu depletieren, aber nicht in vivo in gnotobiotischen Mäusen repliziert werden konnte, die mit demselben Bakterien-Phagen-Konsortium besiedelt waren. Darüber hinaus führte der T7-Phage in einem konventionellen Mausmikrobiom zu einer selektiven Erschöpfung seiner Zieldarmbakterien, obwohl im Laufe der Zeit eine allmähliche Erholung beobachtet wurde, was auf eine entwickelte Resistenz hinweist15. Andere Studien haben die Koexistenz von oral verabreichten Phagen und ihren Zielbakterienstämmen in vivo nachgewiesen 2,16. Tatsächlich führte die Phagenverabreichung über die Koexistenz von Phagen und Bakterien hinaus zu weitreichenden Veränderungen in der Gesamtzusammensetzung und -funktion der Mikrobiota-Gemeinschaft 2,16. Dies ist für Krankheitssituationen relevant, da mehrere Studien Assoziationen zwischen einer erhöhten relativen Abundanz von Caudovirales und IBD gefunden haben 7,8,17, die unabhängig von Veränderungen der bakteriellen Abundanz waren7. Es ist nicht bekannt, ob dies ein Treiber oder eine Folge der Krankheitspathogenese ist.
Der historische Schwerpunkt der Phagenforschung lag auf der Beziehung zwischen einem Phagen und seinem Zielbakterium. Es ist jedoch auch wichtig, mögliche Wechselwirkungen zwischen Phagen und der Schleimhaut, dem Epithel und dem Immunsystem des Metazoenwirts zu berücksichtigen. Diese Wechselwirkungen spielen alle eine wichtige Rolle bei der Gesamtreaktion auf Darmphageninfektionen. Um dies zu demonstrieren, wurden Phagen mit keimfreien (GF) Mäusen untersucht, um ihre Auswirkungen auf das Immunsystem ohne Eingriffe der Mikrobiota aufzuklären8. In diesem System wurden Phagen-Nukleinsäuren durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) nachgewiesen, die sich in Endosomen phagozytärer Immunzellen (Makrophagen und dendritische Zellen) befinden. Dies aktivierte die nachgeschaltete Signalübertragung und stimulierte die T-Zell-abhängige Produktion von Interferon (IFN)-γ8 oder Typ I IFNs18. Darüber hinaus implizierten Flückiger et al.19 Gedächtnis-CD8+ T-Zellen bei der Erkennung von Phagen-kodierten (Prophagen-) Antigenen, was zu einer T-Zell-Kreuzreaktivität mit Tumorantigenen führte, was zu einer verringerten Tumorlast führte. Schließlich wurde die Phagen-spezifische Antikörperproduktion in Mausstudien dokumentiert, in denen Phagen kontinuierlich über Trinkwasser 8,20 oder durch wiederholte orale Sonde über mehrere Monate hinweg an Tiermodelle abgegeben wurden20, was die Fähigkeit von Phagenproteinen zur Förderung humoraler Immunantworten zeigt. Obwohl diese Arten der Phageninokulation eine optimale und kontinuierliche Vorbereitung des Immunsystems ermöglichen, repräsentieren sie möglicherweise nicht die natürlich vorkommenden Wechselwirkungen zwischen Phagen und der Darmumgebung oder die Kinetik der oral angewendeten Phagentherapie. Bisher hat eine begrenzte Anzahl von Studien die Interaktionen von Phagen mit einer einzigen Bakterienart in monokolonisierten Mausmodellen untersucht21. Monokolonisierte Mäuse erwiesen sich jedoch als entscheidend für die Entschlüsselung mikrobenspezifischer Effekte einzelner Spezies auf den Magen-Darm-Trakt und die Immunentwicklung 22,23,24, und sie könnten sich noch als nützlich erweisen, um dreigliedrige Interaktionen zwischen Phagen, ihren Zielbakterien und dem Metazoenwirt zu verstehen.
Spannenderweise gibt es noch viel über die Wechselwirkungen zwischen Darmphagen und Darmkommensalbakterien sowie über die Wechselwirkungen zwischen dem Metazoen-Wirt und den darin befindlichen Phagen zu lernen. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung von isolierten T4-Phagen und seinem bakteriellen Gegenstück, E. coli (K-12, BW25113), unter Verwendung eines gnotobiotischen Mausmodells. Diese standardisierten Verfahren bieten auch eine Grundlage für die Optimierung anderer Phagen/Bakterien-Dyaden, indem die Wachstumsparameter an die interessierenden Paare angepasst werden. Die hier beschriebenen Methoden skizzieren: (1) Herstellung von T4-Phagen- und Vehikellysaten für orale Sonden von Mäusen; (2) Orale Verabreichung von T4-Phagen an monokolonisierte gnotobiotische Mäuse von E. coli ; (3) Überwachung der T4-Phagenspiegel in Mäusekot und -gewebe im Laufe der Zeit.
Für die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse wurden gereinigte T4-Phagenlysate aus Phagenbankbeständen des Rohwer Lab vermehrt. Die Phagen-on-Tap-Methode zur Vermehrung von T4-Phagen wurde angepasst25, wie in diesem Protokoll referenziert. Die Methode liefert innerhalb von drei Tagen Phagenbestände mit hohem Titer und niedrigem Endotoxingehalt. Mit diesem Ansatz wurden routinemäßig 10 ml ≥ 1010 plaquebildende Einheiten (pfu)/ml T4-Phagen mit < 0,5 Endotoxineinheiten (EU)/ml gesammelt. Die empfohlenen Endotoxingehalte für die orale oder intravenöse Verabreichung an Mäuse liegen bei ≤ 20 EU/ml bzw. ≤ 5 EU/kg/h (bzw. 0,1 EU über 1 h für eine 20-g-Maus), was dies zu einer geeigneten Methode der Phagenpräparation für die In-vivo-Inokulation macht. Alle Phagenbestände wurden bei 4 °C in salzhaltigem Magnesium (SM)-Phagenpuffer gelagert (Rezeptur in Schritt 1.1.5.1). E. coli wurde in LB-Medien kultiviert. Für verschiedene Phagen-Bakterien-Paare können verschiedene Nährmedien und Wachstumsbedingungen aus diesem Protokoll angepasst werden. Phagen können auch aus der Umwelt wie Abwasser, Meerwasser, Boden und Darminhalt stammen und können gemäß Sambrook und Russell26 vor der Herstellung unter den geeigneten Wachstums- und Vermehrungsbedingungen für jedes Phagen-Wirt-Paarvon Interesse 25 isoliert und gereinigt werden. Alternativ können Phagen aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle) oder aus Phagenbanken bezogen werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1-octanol (99%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>CAAAA15977-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher BioReagents&#160;</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon&#174; 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer&#174; Tubes, SST</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>365967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioexclusion airtight cages (ISO cages)&#160;</td>
			<td>Techiplast</td>
			<td>1245ISOCAGE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch&#8482; Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>16812612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper coated steel beads (4.5 mm)</td>
			<td>Crosman Corporation</td>
			<td>0767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit (50)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#8482; Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents&#8482;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#8482; Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green FastMix&#174; qPCR mix, 1250 rxns</td>
			<td>QuantaBio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED</td>
			<td>Techiplast</td>
			<td>UISOHEPAXTBOX-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 6000 Incubated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>8354-30-0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-666-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phage stocks</td>
			<td>Carolina Biological Supply&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoLab&#174; Mouse Diet 20 EXT</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>5R58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>A39552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (17,500 U)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase Set</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)</td>
			<td>Fisher scentific&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile flexible film isolator&#160;</td>
			<td>Class Biologically Clean&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#8482; Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AAJ22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, (DNASE, RNASE free)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2484100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t4 bacteriophage and e. coli interaction in the murine intestine: a prototypical model for studying host-bacteriophage dynamics in vivo

Bakteriophagen (Phagen) sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und die am häufigsten vorkommenden biologischen Einheiten in allen bekannten Ökosystemen sind. Innerhalb von Bakteriengemeinschaften, wie sie in der Darmmikrobiota vorkommen, sind Phagen an der Regulierung der Populationsdynamik der Mikrobiota und der Förderung der bakteriellen Evolution beteiligt. In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung wieder gestiegen, zum Teil aufgrund der wirtsspezifischen Abtötungsfähigkeiten lytischer Phagen, die ein vielversprechendes Instrument bieten, um der zunehmenden Bedrohung durch antibiotikaresistente Bakterien entgegenzuwirken. Darüber hinaus deuten neuere Studien, die zeigen, dass Phagen am Darmschleim haften, darauf hin, dass sie eine schützende Rolle bei der Verhinderung des bakteriellen Eindringens in das darunter liegende Epithel spielen könnten. Wichtig ist, dass gestörte Phageome wie bakterielle Mikrobiome mit verschlechterten Ergebnissen bei Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Phagen das Mikrobiom von Tieren und Menschen durch Stuhlfiltrattransplantationen modulieren können, was der Gesundheit des Wirts zugute kommt. Mit dieser jüngsten Forschungswelle geht die Notwendigkeit einher, Protokolle für die Untersuchung von Phagen im Kontext des Darmmikrobioms zu erstellen und zu standardisieren. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung isolierter T4-Phagen und ihres bakteriellen Wirts, Escherichia coli, im Kontext des murinen Magen-Darm-Trakts. Die hier beschriebenen Methoden beschreiben, wie man von einem Phagenlysat ausgeht, es Mäusen verabreicht und die Auswirkungen auf bakterielle Wirts- und Phagenspiegel bewertet. Dieses Protokoll kann modifiziert und auf andere Phagen-Bakterien-Paare angewendet werden und bietet einen Ausgangspunkt für die Untersuchung der Wirt-Phagen-Dynamik in vivo.

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect and kill bacteria with species and strain-level specificity1. Phages play important roles within complex bacterial communities such as the gut microbiota, where they have been implicated in regulating population dynamics and driving bacterial fitness2. Throughout the last decade, there has been renewed interest in phage research owing to the rise of antimicrobial resistant pathogens3, and the potential for phage therapy as an alternative treatment strategy. In recent years, lytic phage cocktails have been used intravenously with some success in serious, antibiotic-resistant bacterial septic infections in humans3,4. Oral phage therapy has also been proposed as a potential alternative to antibiotics to treat intestinal infections and inflammation. Furthermore, phages have been implicated in the success of fecal filtrate transplants (FFT), which are fecal microbiota preparations that have been filtered to remove bacteria, in the treatment of recurrent Clostridioides difficile infection (rCDI)5,6, inflammatory bowel disorders (IBD)7,8&#160;and necrotizing enterocolitis in pre-term pigs9. Given these results, it is important to consider interactions both between phages and the gut microbiota, and phages and the mammalian host, as the addition of novel phages into a preexisting community may have indirect effects on the community as a whole, and not only its target bacteria2,10.
The study of phage interactions with their target bacteria in vitro has proven useful for understanding the mechanisms and impacts of phage and bacteria interactions in the gut. In this setting, it has been shown that Escherichia coli-specific T4 phages of the order Caudovirales require immunoglobulin (Ig)-like domains located within highly antigenic outer capsid (Hoc) proteins on the virion surface to adhere to intestinal mucus11. Additionally, transwell assays have shown that T4 phages are capable of interacting with epithelial cell cultures and translocating through cell layers by macropinocytosis12,13. These results support the hypothesis that phages can interact with their metazoan host, even though they are incapable of infecting eukaryotic cells. These models, while useful, lack the full range of complex interactions that occur in a gut ecosystem that are required for a comprehensive exploration of the tripartite interaction between phages, bacteria and the metazoan host.
Mouse models are an important tool for investigating phages within complex environments. A desirable application of phage administration is as an alternative strategy to treat antimicrobial resistant infections or pathobionts associated with chronic inflammatory diseases, including IBD. However, emerging literature suggests that phage behavior in vitro does not fully represent in vivo functions. Buttimer et al.14&#160;demonstrated that a phage cocktail was able to deplete the targeted bacteria in a simplified human microbiota consortium in vitro, but could not be replicated in vivo in gnotobiotic mice colonized with the same bacteria-phage consortium. Furthermore, in a conventional mouse microbiome, T7 phage led to selective depletion of its target gut bacteria, although gradual recovery was observed over time, indicative of evolved resistance15. Other studies have demonstrated co-existence of orally administered phages and their target bacterial strains in vivo2,16. Indeed, beyond phage/bacteria co-existence, phage administration led to widespread changes in overall microbiota community composition and function2,16. This is relevant in disease settings as several studies have found associations between increased relative abundance of Caudovirales and IBD7,8,17&#160;that were independent of changes in bacterial abundance7. It remains unknown whether this is a driver or consequence of disease pathogenesis.
The historic focus of phage investigation has been around the relationship between a phage and its target bacterium. However, it is also important to consider potential interactions between phage and the mucosa, epithelium, and immune system of the metazoan host. These interactions all play an important role in the overall response to intestinal phage infection. To demonstrate this, phages have been studied using germ-free (GF) mice to elucidate their impact on the immune system without interference by the microbiota8. In this system, phage nucleic acids were detected by Toll-like receptors (TLRs) located within endosomes of phagocytic immune cells (macrophages and dendritic cells). This activated downstream signaling and stimulated T cell dependent production of interferon (IFN)-&#947;8&#160;or type I IFNs18. Moreover, Fluckiger et al.19&#160;implicated memory CD8+ T cells in the recognition of phage-encoded (prophage) antigens, which resulted in T cell cross-reactivity with tumor antigens, resulting in reduced tumor burden. Finally, phage-specific antibody production has been documented in mouse studies where phages were delivered to animal models in a continual manner through drinking water8,20, or by repeated oral gavage over several months20, demonstrating the capacity for phage proteins to promote humoral immune responses. Although these modes of phage inoculation allow for optimal and continual priming of the immune system, they may not represent the naturally occurring interactions between phages and the intestinal environment, nor the kinetics of orally applied phage therapy. Thus far, a limited number of studies have examined the interactions of phage with a single bacterial species in monocolonized mouse models21. However, monocolonized mice proved critical in deciphering microbe-specific effects of individual species on gastrointestinal (GI) tract and immune development22,23,24, and they may yet prove useful in understanding tripartite interactions between phages, their target bacteria, and the metazoan host.
Excitingly, there is still much to learn about the interactions between intestinal phage and gut commensal bacteria, as well as the interactions that occur between the metazoan host and the phages that reside within it. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phage and its&#160;bacterial counterpart, E. coli (K-12, BW25113), using a gnotobiotic mouse model. These standardized procedures also provide a foundation for optimizing other phage/bacteria dyads by adapting the growth parameters to the pairs of interest. The methods described here outline: (1) Preparation of T4 phage and vehicle lysates for oral gavage of mice; (2) Oral administration of T4 phage to E. coli monocolonized gnotobiotic mice; (3) Monitoring T4 phage levels in mouse feces and tissues over time.
For the representative results presented here, purified T4 phage lysates were propagated from phage bank stocks maintained by the Rohwer Lab. The Phage-on-Tap method for propagating T4 phage was adapted25, as referenced in this protocol. The method yields high titer, endotoxin-low phage stocks within three days. Utilizing this approach, 10 mL of &#8805; 1010&#160;plaque forming units (pfu)/mL of T4 phage with &#60; 0.5 endotoxin units (EU)/mL were&#160;routinely collected. The recommended endotoxin levels for oral or intravenous administration into mice are &#8804; 20 EU/mL and &#8804; 5 EU/kg/h (or 0.1 EU administered over 1 h for a 20 g mouse), respectively, making this a suitable method of phage preparation for in vivo inoculation. All phage stocks were stored at 4 &#176;C in saline magnesium (SM) phage buffer (recipe provided in step 1.1.5.1). E. coli was cultivated in LB media. For various phage-bacteria pairs, diverse culture media and growth conditions may be adapted from this protocol. Phages can also be sourced from the environment, such as wastewater, marine water, soil and intestinal contents and can be isolated and purified as per Sambrook and Russell26&#160;prior to preparation using the appropriate growth and propagation conditions for each phage-host pair of interest25. Alternatively, phages can be obtained from commercial sources (see Table of Materials) or from phage banks.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Bakteriophagen-induzierten Immunantworten bei gnotobiotischen Mäusen

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

Um die Wechselwirkungen zwischen der T4-Phagen/E. coli-Dyade im murinen Darm zu untersuchen, wurden T4-Phagen- und Vehikellysate hergestellt, gereinigt und gereinigt (Abbildung 1A). T4-Phagenlysate wurden mittels Plaque-Assay titeriert und in SM-Puffer auf 2 x 107 pfu/ml (2 x 106 pfu/m) verdünnt. Vehikellysate wurden ebenfalls titerisiert, um zu bestätigen, dass keine lebensfähigen Phagen vorhanden sind, und in der gleichen Menge SM-Puffer wie das T4-Phagenl...

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Bakteriophagen (Phagen), Viren, die Bakterien infizieren, sind ein integraler Bestandteil des Darmmikrobioms. Obwohl diese symbiotischen Bewohner die bakterielle Fitness und Populationsdynamik vorantreiben, ist wenig darüber bekannt, wie sie sich auf die Darmhomöostase und -krankheit auswirken. Dieses Protokoll untersucht isolierte T4-Phagen in einem Mausmodell, die an andere Phagen-Bakterien-Paare angepasst werden können.

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, die dreiteiligen Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen, Bakterien und dem Immunsystem von Säugetieren im Kontext des Darms, des gnotobiotischen Mausdarms zu verstehen. Wir hoffen, Einblicke in diese Wechselwirkungen unter Gesundheits- und Krankheitsbedingungen zu gewinnen, um die Bedeutung des Darmmikrobioms besser zu verstehen. Jüngste Entwicklungen haben ergeben, dass Bakteriophagen vom Immunsystem von Säugetieren erkannt werden können.Es wurde vermutet, dass das menschliche Darmphageom bei Krankheitszuständen wie entzündlichen Darmerkrankungen fehlreguliert sein könnte und die Immunstimulation durch Phagen Krankheitsphänotypen verschlimmern könnte. Unser Ziel ist es, anderen ein standardisiertes Protokoll zur Herstellung eines T4-Phagenlysats für die Inokulation und Enumeration in gnotobiotischen Mausmodellen zur Verfügung zu stellen. Diese Protokolle können für die Verwendung mit anderen Bakteriophagen-Bakterienpaaren aufgebaut und modifiziert werden.

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

1.1K Aufrufe.  University of British Columbia. Unsere Forschung zielt darauf ab, die dreiteiligen Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen, Bakterien und dem Immunsystem von Säugetieren im Kontext des Darms, des gnotobiotischen Mausdarms zu verstehen. Wir hoffen, Einblicke in diese Wechselwirkungen unter Gesundheits- und Krankheitsbedingungen zu gewinnen, um die Bedeutung des Darmmikrobioms besser zu verstehen. Jüngste Entwicklungen haben ergeben, dass Bakteriophagen vom Immunsystem von Säugetieren erkannt werden können.Es wurd...

Serie: Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Bakteriophagen-induzierten Immunantworten bei gnotobiotischen Mäusen

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.