Yazarlar, bu araştırmayı yaptıkları arazinin xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Ulusunun geleneksel, atalarından kalma ve işlenmemiş toprakları olduğunu kabul ediyorlar. Üzerinde bulunduğu arazi, binlerce yıldır kültürlerini, tarihlerini ve geleneklerini bu sitede bir nesilden diğerine aktaran Musqueam halkı için her zaman bir öğrenme yeri olmuştur. Diğerlerini, https://native-land.ca'da yaşadıkları ve çalıştıkları yerel topraklar hakkında daha fazla bilgi edinmeye teşvik ediyoruz. Yazarlar, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi (NSERC) Kanada Yüksek Lisans Bursları - Yüksek Lisans (NP), Michael Smith Sağlık Araştırmaları BC Stajyer Ödülü (RT-2023-3174, MH'ye), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif Hibeleri Programı (RGPIN-2019-04591'den CT'ye, RGPIN-2016-04282'den LCO'ya), Kanada İleri Araştırma Enstitüsü / İnsanlar ve Mikrobiyom (FL-001253 Appt 3362, CT'ye), Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı Burs Ödülü (18239, CT'ye), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (PJT-159458'den LCO'ya) ve Kanada İnovasyon Vakfı (34673'ten LCO'ya ve 38277'den CT'ye). UBC GREx Biyolojik Dayanıklılık Girişimi tarafından desteklenen UBC Hastalık Modelleme Merkezi ve ubcFLOW'un teknik desteği için ve makalenin eleştirel tartışmaları ve değerlendirilmesi için Osborne ve Tropini laboratuvarlarının üyelerine minnettarız. Şekil 1A ve Şekil 2A , Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

T4 Faj Kullanarak Murin Modellerinde Bağırsak Faj-Bakteri Dinamiklerini Keşfetmek

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Mikrobiyomdaki fajların incelenmesi, bakteriyel muadillerine kıyasla önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Spesifik olarak, fajlar, sırasıyla prokaryotik ve ökaryotik türlerin dizilenmesinde ve tanımlanmasında kolaylık sağlayan 16S ve 18S ribozomal alt birimlerine benzer tüm fajlarda ortak olan korunmuş bir filogenetik belirteç içermez42. Bununla birlikte, artan okuma uzunlukları, verim ve azalan maliyetler dahil olmak üzere yeni nesil dizileme yaklaşımlarındaki ilerlemelerle b...

Bakteriyofajlar veya fajlar, tür ve suş düzeyinde özgüllük1 ile bakterileri enfekte eden ve öldüren virüslerdir. Fajlar, popülasyon dinamiklerini düzenlemede ve bakteriyel uygunluğu yönlendirmede rol oynadıkları bağırsak mikrobiyotası gibi karmaşık bakteri topluluklarında önemli roller oynarlar2. Son on yıl boyunca, antimikrobiyal dirençli patojenlerin3 yükselişi ve alternatif bir tedavi stratejisi olarak faj tedavisinin potansiyeli nedeniyle faj araştırmalarına olan ilgi yeniden artmıştır. Son yıllarda, litik faj kokteylleri, insanlarda ciddi, antibiyotiğe dirençli bakteriyel septik enfeksiyonlarda bir miktar başarı ile intravenöz olarak kullanılmıştır 3,4. Oral faj tedavisi, bağırsak enfeksiyonlarını ve iltihabı tedavi etmek için antibiyotiklere potansiyel bir alternatif olarak da önerilmiştir. Ayrıca, fajlar, tekrarlayan Clostridioides difficile enfeksiyonu (rCDI)5,6, inflamatuar bağırsak bozuklukları (IBD)7,8 ve erken doğmuş domuzlarda nekrotizan enterokolit tedavisinde bakterileri uzaklaştırmak için filtrelenmiş dışkı mikrobiyota preparatları olan dışkı süzüntü nakillerinin(FFT) başarısında rol oynamıştır. Bu sonuçlar göz önüne alındığında, hem fajlar ve bağırsak mikrobiyotası hem de fajlar ve memeli konakçı arasındaki etkileşimleri dikkate almak önemlidir, çünkü önceden var olan bir topluluğa yeni fajların eklenmesi, yalnızca hedef bakteriler üzerinde değil, bir bütün olarak topluluk üzerinde dolaylı etkilere sahip olabilir 2,10.
Fajların hedef bakterilerle etkileşimlerinin in vitro olarak incelenmesinin, bağırsaktaki faj ve bakteri etkileşimlerinin mekanizmalarını ve etkilerini anlamak için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu ortamda, Caudovirales takımının Escherichia coli'ye özgü T4 fajlarının, bağırsak mukusunayapışmak için virion yüzeyindeki yüksek antijenik dış kapsid (Hoc) proteinleri içinde yer alan immünoglobulin (Ig) benzeri alanlara ihtiyaç duyduğu gösterilmiştir 11. Ek olarak, transwell deneyleri, T4 fajlarının epitel hücre kültürleri ile etkileşime girebildiğini ve makropinositoz12,13 ile hücre katmanları boyunca yer değiştirebildiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, fajların ökaryotik hücreleri enfekte edemeseler bile metazoan konakçılarıyla etkileşime girebilecekleri hipotezini desteklemektedir. Bu modeller, yararlı olmakla birlikte, fajlar, bakteriler ve metazoan konakçı arasındaki üçlü etkileşimin kapsamlı bir şekilde araştırılması için gerekli olan bir bağırsak ekosisteminde meydana gelen tüm karmaşık etkileşimlerden yoksundur.
Fare modelleri, karmaşık ortamlarda fajları araştırmak için önemli bir araçtır. Faj uygulamasının arzu edilen bir uygulaması, IBD dahil olmak üzere kronik enflamatuar hastalıklarla ilişkili antimikrobiyal dirençli enfeksiyonları veya patobiyonları tedavi etmek için alternatif bir stratejidir. Bununla birlikte, ortaya çıkan literatür, in vitro faj davranışının in vivo fonksiyonları tam olarak temsil etmediğini göstermektedir. Buttimer ve ark.14, bir faj kokteylinin, basitleştirilmiş bir insan mikrobiyota konsorsiyumunda hedeflenen bakterileri in vitro olarak tüketebildiğini, ancak aynı bakteri-faj konsorsiyumu ile kolonize edilen gnotobiyotik farelerde in vivo olarak çoğaltılamadığını gösterdi. Ayrıca, geleneksel bir fare mikrobiyomunda, T7 fajı, hedef bağırsak bakterilerinin seçici olarak tükenmesine yol açtı, ancak zaman içinde kademeli iyileşme gözlendi, bu da gelişmiş direncingöstergesi 15. Diğer çalışmalar, oral yoldan uygulanan fajların ve hedef bakteri suşlarının in vivo 2,16 bir arada bulunduğunu göstermiştir. Gerçekten de, faj/bakteri birlikteliğinin ötesinde, faj uygulaması genel mikrobiyota topluluğu bileşiminde ve işlevinde yaygın değişikliklere yol açmıştır 2,16. Bu, hastalık ortamlarında önemlidir, çünkü birkaç çalışma, Caudovirales'in nispi bolluğunun artması ile IBD 7,8,17 arasında bakteri bolluğundaki değişikliklerden bağımsız olarak ilişkiler bulmuştur7. Bunun hastalık patogenezinin bir itici gücü mü yoksa bir sonucu mu olduğu bilinmemektedir.
Faj araştırmasının tarihsel odak noktası, bir faj ile hedef bakteri arasındaki ilişki etrafında olmuştur. Bununla birlikte, faj ile metazoan konağın mukozası, epiteli ve bağışıklık sistemi arasındaki potansiyel etkileşimleri dikkate almak da önemlidir. Bu etkileşimlerin tümü, bağırsak faj enfeksiyonuna verilen genel yanıtta önemli bir rol oynar. Bunu göstermek için, mikrobiyota8'in müdahalesi olmadan bağışıklık sistemi üzerindeki etkilerini aydınlatmak için mikropsuz (GF) fareler kullanılarak fajlar incelenmiştir. Bu sistemde, faj nükleik asitleri, fagositik immün hücrelerin (makrofajlar ve dendritik hücreler) endozomları içinde bulunan Toll benzeri reseptörler (TLR'ler) tarafından tespit edildi. Bu, aşağı akış sinyalini aktive etti ve T hücresine bağlı interferon (IFN)-γ8 veya tip I IFN'ler18 üretimini uyardı. Ayrıca, Fluckiger ve ark.19, faj kodlu (kehanet) antijenlerin tanınmasında bellek CD8+ T hücrelerini kullandılar, bu da tümör antijenleri ile T hücresi çapraz reaktivitesi ile sonuçlandı ve bu da tümör yükünün azalmasına neden oldu. Son olarak, fajlara özgü antikor üretimi, fajların hayvan modellerine içme suyu 8,20 yoluyla sürekli olarak verildiğiveya birkaç ay boyunca tekrarlanan oral gavaj yoluyla20 faj proteinlerinin humoral bağışıklık tepkilerini destekleme kapasitesini gösterdiği fare çalışmalarında belgelenmiştir. Bu faj aşılama modları, bağışıklık sisteminin optimal ve sürekli olarak hazırlanmasına izin verse de, fajlar ve bağırsak ortamı arasında doğal olarak meydana gelen etkileşimleri veya oral yoldan uygulanan faj tedavisinin kinetiğini temsil etmeyebilirler. Şimdiye kadar, sınırlı sayıda çalışma, monokolonize fare modellerinde fajın tek bir bakteri türüyle etkileşimlerini incelemiştir21. Bununla birlikte, monokolonize fareler, bireysel türlerin gastrointestinal (GI) sistem ve bağışıklık gelişimi 22,23,24 üzerindeki mikroplara özgü etkilerinin deşifre edilmesinde kritik olduğunu kanıtlamıştır ve fajlar, hedef bakterileri ve metazoan konakçı arasındaki üçlü etkileşimleri anlamada yararlı olabilirler.
Heyecan verici bir şekilde, bağırsak fajı ve bağırsak kommensal bakterileri arasındaki etkileşimlerin yanı sıra metazoan konakçı ile içinde bulunan fajlar arasında meydana gelen etkileşimler hakkında öğrenilecek çok şey var. Bu protokol, bir gnotobiyotik fare modeli kullanarak izole edilmiş T4 fajını ve bakteriyel muadili E. coli'yi (K-12, BW25113) incelemek için bir dizi prosedür sağlar. Bu standartlaştırılmış prosedürler ayrıca, büyüme parametrelerini ilgilenilen çiftlere uyarlayarak diğer faj/bakteri çiftlerini optimize etmek için bir temel sağlar. Burada açıklanan yöntemler şunları özetlemektedir: (1) Farelerin oral gavajı için T4 faj ve araç lizatlarının hazırlanması; (2) T4 fajının E. coli monokolonize gnotobiyotik farelere oral yoldan verilmesi; (3) Fare dışkısında ve dokularında T4 faj seviyelerinin zaman içinde izlenmesi.
Burada sunulan temsili sonuçlar için, saflaştırılmış T4 faj lizatları, Rohwer Laboratuvarı tarafından tutulan faj bankası stoklarından çoğaltıldı. T4 fajını yaymak için Phage-on-Tap yöntemi, bu protokolde atıfta bulunulduğu gibi25'e uyarlanmıştır. Yöntem, üç gün içinde yüksek titre, endotoksin düşük faj stokları verir. Bu yaklaşım kullanılarak, rutin olarak 10 mL ≥10 10 plak oluşturan birim (pfu)/mL < 0.5 endotoksin birimi (EU)/mL T4 faj toplandı. Farelere oral veya intravenöz uygulama için önerilen endotoksin seviyeleri sırasıyla ≤ 20 EU/mL ve ≤ 5 EU/kg/s'dir (veya 20 g'lık bir fare için 1 saat boyunca uygulanan 0.1 EU), bu da bunu in vivo aşılama için uygun bir faj hazırlama yöntemi haline getirir. Tüm faj stokları 4 °C'de salin magnezyum (SM) faj tamponunda saklandı (tarif adım 1.1.5.1'de verilmiştir). E. coli , LB ortamında yetiştirildi. Çeşitli faj-bakteri çiftleri için, çeşitli kültür ortamları ve büyüme koşulları bu protokolden uyarlanabilir. Fajlar ayrıca atık su, deniz suyu, toprak ve bağırsak içeriği gibi çevreden de elde edilebilir ve ilgilenilen her bir faj-konakçı çifti için uygun büyüme ve yayılma koşulları kullanılarak hazırlanmadan önce Sambrook ve Russell26'ya göre izole edilebilir ve saflaştırılabilir25. Alternatif olarak, fajlar ticari kaynaklardan (bkz . Malzeme Tablosu) veya faj bankalarından elde edilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-octanol (99%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>CAAAA15977-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher BioReagents&#160;</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon&#174; 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer&#174; Tubes, SST</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>365967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioexclusion airtight cages (ISO cages)&#160;</td>
			<td>Techiplast</td>
			<td>1245ISOCAGE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch&#8482; Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>16812612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper coated steel beads (4.5 mm)</td>
			<td>Crosman Corporation</td>
			<td>0767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit (50)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#8482; Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents&#8482;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#8482; Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green FastMix&#174; qPCR mix, 1250 rxns</td>
			<td>QuantaBio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED</td>
			<td>Techiplast</td>
			<td>UISOHEPAXTBOX-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 6000 Incubated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>8354-30-0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-666-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phage stocks</td>
			<td>Carolina Biological Supply&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoLab&#174; Mouse Diet 20 EXT</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>5R58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>A39552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (17,500 U)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase Set</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)</td>
			<td>Fisher scentific&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile flexible film isolator&#160;</td>
			<td>Class Biologically Clean&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#8482; Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AAJ22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, (DNASE, RNASE free)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2484100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t4 bacteriophage and e. coli interaction in the murine intestine: a prototypical model for studying host-bacteriophage dynamics in vivo

Bakteriyofajlar (fajlar), bakterileri tür ve suş düzeyinde özgüllükle enfekte eden virüslerdir ve bilinen tüm ekosistemlerde en bol bulunan biyolojik varlıklardır. Bağırsak mikrobiyotasında bulunanlar gibi bakteri topluluklarında fajlar, mikrobiyota popülasyon dinamiklerini düzenlemede ve bakteri evrimini yönlendirmede rol oynar. Son on yılda, kısmen, antimikrobiyal dirençli bakterilerin artan tehdidine karşı koymak için umut verici bir araç sunan litik fajların konakçıya özgü öldürme yetenekleri nedeniyle, faj araştırmalarına olan ilgi yeniden artmıştır. Ayrıca, fajların bağırsak mukusuna yapıştığını gösteren son çalışmalar, altta yatan epitele bakteri istilasını önlemede koruyucu bir role sahip olabileceklerini düşündürmektedir. Daha da önemlisi, bakteriyel mikrobiyomlar gibi, bozulmuş fageomlar, inflamatuar bağırsak hastalığı gibi hastalıklarda kötüleşen sonuçlarla ilişkilendirilmiştir. Önceki çalışmalar, fajların dışkı süzüntüsü nakli yoluyla hayvanların ve insanların mikrobiyomunu modüle edebildiğini ve konakçının sağlığına fayda sağladığını göstermiştir. Bu son araştırma dalgasıyla birlikte, bağırsak mikrobiyomu bağlamında fajları incelemek için protokoller oluşturma ve standartlaştırma gerekliliği ortaya çıkıyor. Bu protokol, izole edilmiş T4 fajlarını ve bakteriyel konakçıları Escherichia coli'yi murin gastrointestinal sistemi bağlamında incelemek için bir dizi prosedür sağlar. Burada açıklanan yöntemler, bir faj lizatından nasıl başlanacağını, farelere nasıl uygulanacağını ve bakteri konakçısı ve faj seviyeleri üzerindeki etkilerin nasıl değerlendirileceğini özetlemektedir. Bu protokol değiştirilebilir ve diğer faj-bakteri çiftlerine uygulanabilir ve konak-faj dinamiklerini in vivo olarak incelemek için bir başlangıç noktası sağlar.

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect and kill bacteria with species and strain-level specificity1. Phages play important roles within complex bacterial communities such as the gut microbiota, where they have been implicated in regulating population dynamics and driving bacterial fitness2. Throughout the last decade, there has been renewed interest in phage research owing to the rise of antimicrobial resistant pathogens3, and the potential for phage therapy as an alternative treatment strategy. In recent years, lytic phage cocktails have been used intravenously with some success in serious, antibiotic-resistant bacterial septic infections in humans3,4. Oral phage therapy has also been proposed as a potential alternative to antibiotics to treat intestinal infections and inflammation. Furthermore, phages have been implicated in the success of fecal filtrate transplants (FFT), which are fecal microbiota preparations that have been filtered to remove bacteria, in the treatment of recurrent Clostridioides difficile infection (rCDI)5,6, inflammatory bowel disorders (IBD)7,8&#160;and necrotizing enterocolitis in pre-term pigs9. Given these results, it is important to consider interactions both between phages and the gut microbiota, and phages and the mammalian host, as the addition of novel phages into a preexisting community may have indirect effects on the community as a whole, and not only its target bacteria2,10.
The study of phage interactions with their target bacteria in vitro has proven useful for understanding the mechanisms and impacts of phage and bacteria interactions in the gut. In this setting, it has been shown that Escherichia coli-specific T4 phages of the order Caudovirales require immunoglobulin (Ig)-like domains located within highly antigenic outer capsid (Hoc) proteins on the virion surface to adhere to intestinal mucus11. Additionally, transwell assays have shown that T4 phages are capable of interacting with epithelial cell cultures and translocating through cell layers by macropinocytosis12,13. These results support the hypothesis that phages can interact with their metazoan host, even though they are incapable of infecting eukaryotic cells. These models, while useful, lack the full range of complex interactions that occur in a gut ecosystem that are required for a comprehensive exploration of the tripartite interaction between phages, bacteria and the metazoan host.
Mouse models are an important tool for investigating phages within complex environments. A desirable application of phage administration is as an alternative strategy to treat antimicrobial resistant infections or pathobionts associated with chronic inflammatory diseases, including IBD. However, emerging literature suggests that phage behavior in vitro does not fully represent in vivo functions. Buttimer et al.14&#160;demonstrated that a phage cocktail was able to deplete the targeted bacteria in a simplified human microbiota consortium in vitro, but could not be replicated in vivo in gnotobiotic mice colonized with the same bacteria-phage consortium. Furthermore, in a conventional mouse microbiome, T7 phage led to selective depletion of its target gut bacteria, although gradual recovery was observed over time, indicative of evolved resistance15. Other studies have demonstrated co-existence of orally administered phages and their target bacterial strains in vivo2,16. Indeed, beyond phage/bacteria co-existence, phage administration led to widespread changes in overall microbiota community composition and function2,16. This is relevant in disease settings as several studies have found associations between increased relative abundance of Caudovirales and IBD7,8,17&#160;that were independent of changes in bacterial abundance7. It remains unknown whether this is a driver or consequence of disease pathogenesis.
The historic focus of phage investigation has been around the relationship between a phage and its target bacterium. However, it is also important to consider potential interactions between phage and the mucosa, epithelium, and immune system of the metazoan host. These interactions all play an important role in the overall response to intestinal phage infection. To demonstrate this, phages have been studied using germ-free (GF) mice to elucidate their impact on the immune system without interference by the microbiota8. In this system, phage nucleic acids were detected by Toll-like receptors (TLRs) located within endosomes of phagocytic immune cells (macrophages and dendritic cells). This activated downstream signaling and stimulated T cell dependent production of interferon (IFN)-&#947;8&#160;or type I IFNs18. Moreover, Fluckiger et al.19&#160;implicated memory CD8+ T cells in the recognition of phage-encoded (prophage) antigens, which resulted in T cell cross-reactivity with tumor antigens, resulting in reduced tumor burden. Finally, phage-specific antibody production has been documented in mouse studies where phages were delivered to animal models in a continual manner through drinking water8,20, or by repeated oral gavage over several months20, demonstrating the capacity for phage proteins to promote humoral immune responses. Although these modes of phage inoculation allow for optimal and continual priming of the immune system, they may not represent the naturally occurring interactions between phages and the intestinal environment, nor the kinetics of orally applied phage therapy. Thus far, a limited number of studies have examined the interactions of phage with a single bacterial species in monocolonized mouse models21. However, monocolonized mice proved critical in deciphering microbe-specific effects of individual species on gastrointestinal (GI) tract and immune development22,23,24, and they may yet prove useful in understanding tripartite interactions between phages, their target bacteria, and the metazoan host.
Excitingly, there is still much to learn about the interactions between intestinal phage and gut commensal bacteria, as well as the interactions that occur between the metazoan host and the phages that reside within it. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phage and its&#160;bacterial counterpart, E. coli (K-12, BW25113), using a gnotobiotic mouse model. These standardized procedures also provide a foundation for optimizing other phage/bacteria dyads by adapting the growth parameters to the pairs of interest. The methods described here outline: (1) Preparation of T4 phage and vehicle lysates for oral gavage of mice; (2) Oral administration of T4 phage to E. coli monocolonized gnotobiotic mice; (3) Monitoring T4 phage levels in mouse feces and tissues over time.
For the representative results presented here, purified T4 phage lysates were propagated from phage bank stocks maintained by the Rohwer Lab. The Phage-on-Tap method for propagating T4 phage was adapted25, as referenced in this protocol. The method yields high titer, endotoxin-low phage stocks within three days. Utilizing this approach, 10 mL of &#8805; 1010&#160;plaque forming units (pfu)/mL of T4 phage with &#60; 0.5 endotoxin units (EU)/mL were&#160;routinely collected. The recommended endotoxin levels for oral or intravenous administration into mice are &#8804; 20 EU/mL and &#8804; 5 EU/kg/h (or 0.1 EU administered over 1 h for a 20 g mouse), respectively, making this a suitable method of phage preparation for in vivo inoculation. All phage stocks were stored at 4 &#176;C in saline magnesium (SM) phage buffer (recipe provided in step 1.1.5.1). E. coli was cultivated in LB media. For various phage-bacteria pairs, diverse culture media and growth conditions may be adapted from this protocol. Phages can also be sourced from the environment, such as wastewater, marine water, soil and intestinal contents and can be isolated and purified as per Sambrook and Russell26&#160;prior to preparation using the appropriate growth and propagation conditions for each phage-host pair of interest25. Alternatively, phages can be obtained from commercial sources (see Table of Materials) or from phage banks.

Yazar Spotlight: Gnotobiyotik Farelerde Bakteriyofaj Kaynaklı Bağışıklık Tepkilerinin Araştırılması

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Our research aims to understand the tripartite interactions between bacteriophages bacteria and the mammalian immune system within the context of the gut, gnotobiotic mouse gut. We hope to gain insight into these interactions under health and disease conditions to better-understand the importance of the gut microbiome. Recent developments have found that bacteriophages can be detected by the mammalian immune system.It has been suggested that the human gut phageome may be dysregulated in disease conditions such as inflammatory bowel disorder, and immune stimulation by phages could exacerbate disease phenotypes. Our goal is to provide others with a standardized protocol for producing a T4 phage lysate for inoculation and enumeration in gnotobiotic mouse models. These protocols can be built upon and modified for use with other bacteriophage bacteria pairs.

Fare bağırsağında T4 faj/E. coli dyad arasındaki etkileşimleri araştırmak için T4 fajı ve araç lizatları hazırlandı, temizlendi ve saflaştırıldı (Şekil 1A). T4 faj lizatları plak testi ile titre edildi ve SM tamponunda 2 x 107 pfu/mL'ye (2 x 106 pfu/fare) seyreltildi. Araç lizatları ayrıca canlı faj varlığını doğrulamak için titre edildi ve T4 faj lizatı ile aynı hacimde SM tamponu içinde seyreltildi. Endotoksin seviyeleri, bir ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Investigating Bacteriophage-Induced Immune Responses in Gnotobiotic Mice at JoVE.com

Bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlar (fajlar), bağırsak mikrobiyomunun ayrılmaz bir bileşenidir. Bu simbiyotik sakinler bakteriyel zindeliği ve popülasyon dinamiklerini yönlendirse de, bağırsak homeostazını ve hastalığını nasıl etkiledikleri hakkında çok az şey anlaşılmıştır. Bu protokol, diğer faj-bakteri çiftlerine uyarlanabilen bir fare modeli içinde izole edilmiş T4 fajlarını inceler.

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Araştırmamız, bakteriyofajlar, bakteriler ve memeli bağışıklık sistemi arasındaki üçlü etkileşimleri bağırsak, gnotobiyotik fare bağırsağı bağlamında anlamayı amaçlamaktadır. Bağırsak mikrobiyomunun önemini daha iyi anlamak için sağlık ve hastalık koşulları altında bu etkileşimler hakkında fikir edinmeyi umuyoruz. Son gelişmeler, bakteriyofajların memeli bağışıklık sistemi tarafından tespit edilebileceğini bulmuştur.İnsan bağırsak fagomunun inflamatuar bağırsak bozukluğu gibi hastalık durumlarında düzensiz olabileceği ve fajlar tarafından immün stimülasyonun hastalık fenotiplerini şiddetlendirebileceği öne sürülmüştür. Amacımız, diğerlerine gnotobiyotik fare modellerinde aşılama ve sayım için bir T4 faj lizatı üretmek için standart bir protokol sağlamaktır. Bu protokoller, diğer bakteriyofaj bakteri çiftleri ile kullanım için oluşturulabilir ve değiştirilebilir.

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

1.0K Görüntüleme.  University of British Columbia. Araştırmamız, bakteriyofajlar, bakteriler ve memeli bağışıklık sistemi arasındaki üçlü etkileşimleri bağırsak, gnotobiyotik fare bağırsağı bağlamında anlamayı amaçlamaktadır. Bağırsak mikrobiyomunun önemini daha iyi anlamak için sağlık ve hastalık koşulları altında bu etkileşimler hakkında fikir edinmeyi umuyoruz. Son gelişmeler, bakteriyofajların memeli bağışıklık sistemi tarafından tespit edilebileceğini bulmuştur.İnsan bağırsak fagomu...