Les auteurs reconnaissent que les terres sur lesquelles ils ont effectué cette recherche sont le territoire traditionnel, ancestral et non cédé de la nation xwməθkwəy̓əm (Musqueam). La terre sur laquelle il est situé a toujours été un lieu d’apprentissage pour le peuple Musqueam, qui depuis des millénaires transmet sa culture, son histoire et ses traditions d’une génération à l’autre sur ce site. Nous encourageons les autres à en apprendre davantage sur les terres autochtones dans lesquelles ils vivent et travaillent à https://native-land.ca. Les auteurs remercient le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) pour le soutien des bourses d’études supérieures du Canada - maîtrise (N.P.), de la bourse de stagiaire Michael Smith Health Research BC (RT-2023-3174, à MH), du Programme de subventions à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (RGPIN-2019-04591 à C.T., RGPIN-2016-04282 à la CDO), de l’Institut canadien de recherches avancées / L’humain et le microbiome (FL-001253 Appt 3362, à C.T.), la bourse de boursier de la Fondation Michael-Smith pour la recherche en santé (18239, à C.T.), les Instituts de recherche en santé du Canada (PJT-159458 à la CDO) et la Fondation canadienne pour l’innovation (34673 à la CDO et 38277 à CT). Nous sommes reconnaissants du soutien technique du Centre de modélisation des maladies de l’Université de la Colombie-Britannique et d’ubcFLOW, qui est soutenu par l’initiative de résilience biologique GREx de l’Université de la Colombie-Britannique, ainsi que des membres des laboratoires Osborne et Tropini pour les discussions critiques et l’évaluation du manuscrit. Les figures 1A et 2A ont été créées à l’aide de Biorender.com.

Exploration de la dynamique phage-bactérie intestinale dans des modèles murins à l’aide de phages T4

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’étude des phages dans le microbiome présente un défi important par rapport à leurs homologues bactériens. Plus précisément, les phages ne contiennent pas de marqueur phylogénétique conservé commun à tous les phages apparenté aux sous-unités ribosomales 16S et 18S qui permettent de faciliter le séquençage et l’identification des espèces procaryotes et eucaryotes, respectivement42. Cependant, avec les progrès des approches de séquençage de nouvelle génération, y compris l?...

Les bactériophages, ou phages, sont des virus qui infectent et tuent les bactéries avec une spécificité au niveau de l’espèce et de la souche1. Les phages jouent un rôle important dans les communautés bactériennes complexes telles que le microbiote intestinal, où ils ont été impliqués dans la régulation de la dynamique des populations et la conduite de la fitness bactérienne2. Au cours de la dernière décennie, il y a eu un regain d’intérêt pour la recherche sur les phages en raison de l’augmentation des agents pathogènes résistants aux antimicrobiens3 et du potentiel de la phagothérapie comme stratégie de traitement alternative. Ces dernières années, les cocktails de phages lytiques ont été utilisés par voie intraveineuse avec un certain succès dans les infections septiques bactériennes graves et résistantes aux antibiotiques chez l’homme 3,4. La phagothérapie orale a également été proposée comme alternative potentielle aux antibiotiques pour traiter les infections intestinales et l’inflammation. De plus, les phages ont été impliqués dans le succès des greffes de filtrat fécal (FFT), qui sont des préparations de microbiote fécal filtrées pour éliminer les bactéries, dans le traitement de l’infection récurrente à Clostridioides difficile (ICDr)5,6, des troubles inflammatoires de l’intestin (MICI)7,8 et de l’entérocolite nécrosante chez les porcs prématurés9. Compte tenu de ces résultats, il est important de prendre en compte les interactions entre les phages et le microbiote intestinal, et entre les phages et l’hôte mammifère, car l’ajout de nouveaux phages dans une communauté préexistante peut avoir des effets indirects sur la communauté dans son ensemble, et pas seulement sur ses bactéries cibles 2,10.
L’étude in vitro des interactions des phages avec leurs bactéries cibles s’est avérée utile pour comprendre les mécanismes et les impacts des interactions phages et bactéries dans l’intestin. Dans ce contexte, il a été démontré que les phages T4 spécifiques d’Escherichia coli de l’ordre des Caudovirales ont besoin de domaines de type immunoglobuline (Ig) situés dans des protéines de capside externe (Hoc) hautement antigéniques à la surface du virion pour adhérer au mucus intestinal11. De plus, des tests transwell ont montré que les phages T4 sont capables d’interagir avec les cultures de cellules épithéliales et de se déplacer à travers les couches cellulaires par macropinocytose12,13. Ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle les phages peuvent interagir avec leur hôte métazoaire, même s’ils sont incapables d’infecter les cellules eucaryotes. Ces modèles, bien qu’utiles, ne disposent pas de toute la gamme d’interactions complexes qui se produisent dans un écosystème intestinal et qui sont nécessaires à une exploration complète de l’interaction tripartite entre les phages, les bactéries et l’hôte métazoaire.
Les modèles murins sont un outil important pour étudier les phages dans des environnements complexes. Une application souhaitable de l’administration de phages est une stratégie alternative pour traiter les infections résistantes aux antimicrobiens ou les agents pathogènes associés aux maladies inflammatoires chroniques, y compris les MICI. Cependant, la littérature émergente suggère que le comportement des phages in vitro ne représente pas pleinement les fonctions in vivo. Buttimer et al.14 ont démontré qu’un cocktail de phages était capable d’épuiser les bactéries ciblées dans un consortium simplifié de microbiote humain in vitro, mais ne pouvait pas être répliqué in vivo chez des souris gnotobiotiques colonisées par le même consortium bactéries-phages. De plus, dans un microbiome de souris conventionnel, le phage T7 a entraîné un épuisement sélectif de ses bactéries intestinales cibles, bien qu’une récupération progressive ait été observée au fil du temps, indiquant une résistance évoluée15. D’autres études ont démontré la coexistence de phages administrés par voie orale et de leurs souches bactériennes cibles in vivo 2,16. En effet, au-delà de la coexistence phage/bactérie, l’administration de phages a entraîné des changements généralisés dans la composition et la fonction globales de la communauté du microbiote 2,16. Ceci est pertinent dans les contextes pathologiques, car plusieurs études ont trouvé des associations entre l’augmentation de l’abondance relative des Caudovirales et des MICI 7,8,17 qui étaient indépendantes des changements dans l’abondance bactérienne7. On ne sait pas encore s’il s’agit d’un facteur ou d’une conséquence de la pathogenèse de la maladie.
L’objectif historique de l’étude des phages a été la relation entre un phage et sa bactérie cible. Cependant, il est également important de prendre en compte les interactions potentielles entre le phage et la muqueuse, l’épithélium et le système immunitaire de l’hôte métazoaire. Ces interactions jouent toutes un rôle important dans la réponse globale à l’infection intestinale par les phages. Pour le démontrer, des phages ont été étudiés sur des souris sans germes (GF) afin d’élucider leur impact sur le système immunitaire sans interférence du microbiote8. Dans ce système, les acides nucléiques des phages ont été détectés par des récepteurs de type Toll (TLR) situés dans les endosomes des cellules immunitaires phagocytaires (macrophages et cellules dendritiques). Cela a activé la signalisation en aval et stimulé la production d’interféron (IFN)-γ8 ou d’IFNs de type I18 dépendant des lymphocytes T. De plus, Fluckiger et al.19 ont impliqué les lymphocytes T CD8+ mémoires dans la reconnaissance des antigènes codés par des phages (prophages), ce qui a entraîné une réactivité croisée des lymphocytes T avec les antigènes tumoraux, ce qui a entraîné une réduction de la charge tumorale. Enfin, la production d’anticorps spécifiques aux phages a été documentée dans des études sur des souris où des phages ont été délivrés à des modèles animaux de manière continue par l’eau potable 8,20, ou par gavage oral répété pendant plusieurs mois20, démontrant la capacité des protéines des phages à promouvoir des réponses immunitaires humorales. Bien que ces modes d’inoculation des phages permettent un amorçage optimal et continu du système immunitaire, ils peuvent ne pas représenter les interactions naturelles entre les phages et l’environnement intestinal, ni la cinétique de la phagothérapie appliquée par voie orale. Jusqu’à présent, un nombre limité d’études ont examiné les interactions d’un phage avec une seule espèce bactérienne dans des modèles murins monocolonisés21. Cependant, les souris monocolonisées se sont avérées essentielles pour déchiffrer les effets spécifiques des microbes des espèces individuelles sur le tractus gastro-intestinal (GI) et le développement immunitaire 22,23,24, et elles peuvent encore s’avérer utiles pour comprendre les interactions tripartites entre les phages, leurs bactéries cibles et l’hôte métazoaire.
Il est passionnant de constater qu’il reste encore beaucoup à apprendre sur les interactions entre les phages intestinaux et les bactéries commensales intestinales, ainsi que sur les interactions qui se produisent entre l’hôte métazoaire et les phages qui y résident. Ce protocole fournit un ensemble de procédures pour étudier le phage T4 isolé et son homologue bactérien, E. coli (K-12, BW25113), à l’aide d’un modèle murin gnotobiotique. Ces procédures standardisées fournissent également une base pour optimiser d’autres dyades phage/bactérie en adaptant les paramètres de croissance aux paires d’intérêt. Les méthodes décrites ici décrivent : (1) la préparation de lysats de phages et de véhicules T4 pour le gavage oral de souris ; (2) Administration orale de phage T4 à des souris gnotobiotiques monocolonisées par E. coli ; (3) Surveillance des niveaux de phages T4 dans les excréments et les tissus de souris au fil du temps.
Pour les résultats représentatifs présentés ici, des lysats de phages T4 purifiés ont été propagés à partir de stocks de banques de phages maintenus par le laboratoire Rohwer. La méthode Phage-on-Tap pour la propagation du phage T4 a été adaptée25, comme indiqué dans ce protocole. La méthode permet d’obtenir des stocks de phages à titre élevé et à faible teneur en endotoxines en trois jours. En utilisant cette approche, 10 mL de ≥ 1010 unités formant des plaques (UFP)/mL de phage T4 avec < 0,5 unité d’endotoxine (UE)/mL ont été collectés régulièrement. Les teneurs en endotoxines recommandées pour l’administration orale ou intraveineuse chez la souris sont respectivement de ≤ 20 UE/ml et ≤ de 5 UE/kg/h (ou 0,1 UE administrée en 1 heure pour une souris de 20 g), ce qui en fait une méthode appropriée de préparation de phages pour l’inoculation in vivo . Tous les stocks de phages ont été stockés à 4 °C dans un tampon de magnésium salin (SM) (recette fournie à l’étape 1.1.5.1). E. coli a été cultivé dans des milieux LB. Pour diverses paires phage-bactérie, divers milieux de culture et conditions de croissance peuvent être adaptés à partir de ce protocole. Les phages peuvent également provenir de l’environnement, comme les eaux usées, l’eau de mer, le sol et le contenu intestinal, et peuvent être isolés et purifiés selon Sambrook et Russell26 avant la préparation en utilisant les conditions de croissance et de propagation appropriées pour chaque paire phage-hôte d’intérêt25. Les phages peuvent également être obtenus auprès de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) ou de banques de phages.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-octanol (99%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>CAAAA15977-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Fisher BioReagents&#160;</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon&#174; 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainer&#174; Tubes, SST</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>365967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioexclusion airtight cages (ISO cages)&#160;</td>
			<td>Techiplast</td>
			<td>1245ISOCAGE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch&#8482; Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk</td>
			<td>Andwin Scientific&#160;</td>
			<td>16812612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper coated steel beads (4.5 mm)</td>
			<td>Crosman Corporation</td>
			<td>0767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit (50)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#8482; Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents&#8482;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#8482; Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green FastMix&#174; qPCR mix, 1250 rxns</td>
			<td>QuantaBio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED</td>
			<td>Techiplast</td>
			<td>UISOHEPAXTBOX-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 6000 Incubated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>8354-30-0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-666-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phage stocks</td>
			<td>Carolina Biological Supply&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoLab&#174; Mouse Diet 20 EXT</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>5R58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>A39552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (17,500 U)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase Set</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)</td>
			<td>Fisher scentific&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile flexible film isolator&#160;</td>
			<td>Class Biologically Clean&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#8482; Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AAJ22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, (DNASE, RNASE free)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2484100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t4 bacteriophage and e. coli interaction in the murine intestine: a prototypical model for studying host-bacteriophage dynamics in vivo

Les bactériophages (phages) sont des virus qui infectent les bactéries avec une spécificité au niveau de l’espèce et de la souche et sont les entités biologiques les plus abondantes dans tous les écosystèmes connus. Au sein des communautés bactériennes, telles que celles que l’on trouve dans le microbiote intestinal, les phages sont impliqués dans la régulation de la dynamique des populations de microbiote et dans l’évolution bactérienne. La recherche sur les phages a connu un regain d’intérêt au cours de la dernière décennie, en partie en raison des capacités de destruction spécifiques à l’hôte des phages lytiques, qui offrent un outil prometteur pour contrer la menace croissante des bactéries résistantes aux antimicrobiens. De plus, des études récentes démontrant que les phages adhèrent au mucus intestinal suggèrent qu’ils pourraient avoir un rôle protecteur dans la prévention de l’invasion bactérienne dans l’épithélium sous-jacent. Il est important de noter que, comme les microbiomes bactériens, les phagéomes perturbés ont été associés à une aggravation des résultats dans des maladies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin. Des études antérieures ont démontré que les phages peuvent moduler le microbiome des animaux et des humains grâce à des greffes de filtrat fécal, ce qui est bénéfique pour la santé de l’hôte. Cette récente vague de recherche s’accompagne de la nécessité d’établir et de normaliser des protocoles pour étudier les phages dans le contexte du microbiome intestinal. Ce protocole fournit un ensemble de procédures pour étudier les phages T4 isolés et leur hôte bactérien, Escherichia coli, dans le contexte du tractus gastro-intestinal murin. Les méthodes décrites ici décrivent comment partir d’un lysat de phage, l’administrer à des souris et évaluer les effets sur l’hôte bactérien et les niveaux de phages. Ce protocole peut être modifié et appliqué à d’autres paires phage-bactérie et fournit un point de départ pour étudier la dynamique hôte-phage in vivo.

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect and kill bacteria with species and strain-level specificity1. Phages play important roles within complex bacterial communities such as the gut microbiota, where they have been implicated in regulating population dynamics and driving bacterial fitness2. Throughout the last decade, there has been renewed interest in phage research owing to the rise of antimicrobial resistant pathogens3, and the potential for phage therapy as an alternative treatment strategy. In recent years, lytic phage cocktails have been used intravenously with some success in serious, antibiotic-resistant bacterial septic infections in humans3,4. Oral phage therapy has also been proposed as a potential alternative to antibiotics to treat intestinal infections and inflammation. Furthermore, phages have been implicated in the success of fecal filtrate transplants (FFT), which are fecal microbiota preparations that have been filtered to remove bacteria, in the treatment of recurrent Clostridioides difficile infection (rCDI)5,6, inflammatory bowel disorders (IBD)7,8&#160;and necrotizing enterocolitis in pre-term pigs9. Given these results, it is important to consider interactions both between phages and the gut microbiota, and phages and the mammalian host, as the addition of novel phages into a preexisting community may have indirect effects on the community as a whole, and not only its target bacteria2,10.
The study of phage interactions with their target bacteria in vitro has proven useful for understanding the mechanisms and impacts of phage and bacteria interactions in the gut. In this setting, it has been shown that Escherichia coli-specific T4 phages of the order Caudovirales require immunoglobulin (Ig)-like domains located within highly antigenic outer capsid (Hoc) proteins on the virion surface to adhere to intestinal mucus11. Additionally, transwell assays have shown that T4 phages are capable of interacting with epithelial cell cultures and translocating through cell layers by macropinocytosis12,13. These results support the hypothesis that phages can interact with their metazoan host, even though they are incapable of infecting eukaryotic cells. These models, while useful, lack the full range of complex interactions that occur in a gut ecosystem that are required for a comprehensive exploration of the tripartite interaction between phages, bacteria and the metazoan host.
Mouse models are an important tool for investigating phages within complex environments. A desirable application of phage administration is as an alternative strategy to treat antimicrobial resistant infections or pathobionts associated with chronic inflammatory diseases, including IBD. However, emerging literature suggests that phage behavior in vitro does not fully represent in vivo functions. Buttimer et al.14&#160;demonstrated that a phage cocktail was able to deplete the targeted bacteria in a simplified human microbiota consortium in vitro, but could not be replicated in vivo in gnotobiotic mice colonized with the same bacteria-phage consortium. Furthermore, in a conventional mouse microbiome, T7 phage led to selective depletion of its target gut bacteria, although gradual recovery was observed over time, indicative of evolved resistance15. Other studies have demonstrated co-existence of orally administered phages and their target bacterial strains in vivo2,16. Indeed, beyond phage/bacteria co-existence, phage administration led to widespread changes in overall microbiota community composition and function2,16. This is relevant in disease settings as several studies have found associations between increased relative abundance of Caudovirales and IBD7,8,17&#160;that were independent of changes in bacterial abundance7. It remains unknown whether this is a driver or consequence of disease pathogenesis.
The historic focus of phage investigation has been around the relationship between a phage and its target bacterium. However, it is also important to consider potential interactions between phage and the mucosa, epithelium, and immune system of the metazoan host. These interactions all play an important role in the overall response to intestinal phage infection. To demonstrate this, phages have been studied using germ-free (GF) mice to elucidate their impact on the immune system without interference by the microbiota8. In this system, phage nucleic acids were detected by Toll-like receptors (TLRs) located within endosomes of phagocytic immune cells (macrophages and dendritic cells). This activated downstream signaling and stimulated T cell dependent production of interferon (IFN)-&#947;8&#160;or type I IFNs18. Moreover, Fluckiger et al.19&#160;implicated memory CD8+ T cells in the recognition of phage-encoded (prophage) antigens, which resulted in T cell cross-reactivity with tumor antigens, resulting in reduced tumor burden. Finally, phage-specific antibody production has been documented in mouse studies where phages were delivered to animal models in a continual manner through drinking water8,20, or by repeated oral gavage over several months20, demonstrating the capacity for phage proteins to promote humoral immune responses. Although these modes of phage inoculation allow for optimal and continual priming of the immune system, they may not represent the naturally occurring interactions between phages and the intestinal environment, nor the kinetics of orally applied phage therapy. Thus far, a limited number of studies have examined the interactions of phage with a single bacterial species in monocolonized mouse models21. However, monocolonized mice proved critical in deciphering microbe-specific effects of individual species on gastrointestinal (GI) tract and immune development22,23,24, and they may yet prove useful in understanding tripartite interactions between phages, their target bacteria, and the metazoan host.
Excitingly, there is still much to learn about the interactions between intestinal phage and gut commensal bacteria, as well as the interactions that occur between the metazoan host and the phages that reside within it. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phage and its&#160;bacterial counterpart, E. coli (K-12, BW25113), using a gnotobiotic mouse model. These standardized procedures also provide a foundation for optimizing other phage/bacteria dyads by adapting the growth parameters to the pairs of interest. The methods described here outline: (1) Preparation of T4 phage and vehicle lysates for oral gavage of mice; (2) Oral administration of T4 phage to E. coli monocolonized gnotobiotic mice; (3) Monitoring T4 phage levels in mouse feces and tissues over time.
For the representative results presented here, purified T4 phage lysates were propagated from phage bank stocks maintained by the Rohwer Lab. The Phage-on-Tap method for propagating T4 phage was adapted25, as referenced in this protocol. The method yields high titer, endotoxin-low phage stocks within three days. Utilizing this approach, 10 mL of &#8805; 1010&#160;plaque forming units (pfu)/mL of T4 phage with &#60; 0.5 endotoxin units (EU)/mL were&#160;routinely collected. The recommended endotoxin levels for oral or intravenous administration into mice are &#8804; 20 EU/mL and &#8804; 5 EU/kg/h (or 0.1 EU administered over 1 h for a 20 g mouse), respectively, making this a suitable method of phage preparation for in vivo inoculation. All phage stocks were stored at 4 &#176;C in saline magnesium (SM) phage buffer (recipe provided in step 1.1.5.1). E. coli was cultivated in LB media. For various phage-bacteria pairs, diverse culture media and growth conditions may be adapted from this protocol. Phages can also be sourced from the environment, such as wastewater, marine water, soil and intestinal contents and can be isolated and purified as per Sambrook and Russell26&#160;prior to preparation using the appropriate growth and propagation conditions for each phage-host pair of interest25. Alternatively, phages can be obtained from commercial sources (see Table of Materials) or from phage banks.

Pleins feux sur l’auteur : Étude des réponses immunitaires induites par les bactériophages chez les souris gnotobiotiques

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Pour étudier les interactions entre la dyade phage/E. coli T4 dans l’intestin murin, le phage T4 et les lysats de véhicule ont été préparés, nettoyés et purifiés (Figure 1A). Les lysats de phages T4 ont été titrés par test sur plaque et dilués à 2 x 107 pfu/mL (2 x 106 pfu/souris) dans un tampon SM. Les lysats de véhicule ont également été titrés pour confirmer l’absence de présence de phages viables et dilués dans le même volume de tam...

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Les bactériophages (phages), des virus qui infectent les bactéries, font partie intégrante du microbiome intestinal. Bien que ces habitants symbiotiques déterminent la forme physique bactérienne et la dynamique des populations, on comprend peu de choses sur leur impact sur l’homéostasie intestinale et les maladies. Ce protocole étudie des phages T4 isolés dans un modèle murin, adaptable à d’autres paires phage-bactérie.

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Notre recherche vise à comprendre les interactions tripartites entre les bactériophages, les bactéries et le système immunitaire des mammifères dans le contexte de l’intestin, de l’intestin gnotobiotique de souris. Nous espérons mieux comprendre ces interactions dans des conditions de santé et de maladie afin de mieux comprendre l’importance du microbiome intestinal. Des développements récents ont montré que les bactériophages peuvent être détectés par le système immunitaire des mammifères.Il a été suggéré que le phageome intestinal humain peut être dérégulé dans des conditions pathologiques telles que les troubles inflammatoires de l’intestin, et que la stimulation immunitaire par les phages pourrait exacerber les phénotypes de la maladie. Notre objectif est de fournir à d’autres un protocole standardisé pour la production d’un lysat de phage T4 pour l’inoculation et le dénombrement dans des modèles murins gnotobiotiques. Ces protocoles peuvent être construits et modifiés pour être utilisés avec d’autres paires de bactéries bactériophages.

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

1.1K vues.  University of British Columbia. Notre recherche vise à comprendre les interactions tripartites entre les bactériophages, les bactéries et le système immunitaire des mammifères dans le contexte de l’intestin, de l’intestin gnotobiotique de souris. Nous espérons mieux comprendre ces interactions dans des conditions de santé et de maladie afin de mieux comprendre l’importance du microbiome intestinal. Des développements récents ont montré que les bactériophages peuvent être détectés par le système immunita...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Étude des réponses immunitaires induites par les bactériophages chez les souris gnotobiotiques

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.