Diese Studie wurde von der Agence Nationale de la Recherche (ANR Projekt-2010-BLAN-1535) und durch einen Zuschuss von Region Ile-de-France (DIM-Malinf 110058) unterstützt.

1. Produktion von rekombinanten Proteinen <ol><li> Mexa, MexB aus Pseudomonas aeruginosa <ol><li> Transformieren Sie die Plasmide, die MEXA und MexB Gene in einem E. coli-Produktionsstamm (zB C43 DE3). Platte auf LB-Agar-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt. Wählen Sie eine einzelne Kolonie, um eine O / N Vorkultur zu impfen. Am nächsten Morgen, impfen die Vorkultur in 1 l LB und wachsen bei 37 ° C unter Rühren (240 UpM). </li><li> Sobald die Zellen die exponentielle Phase erreicht (OD 600 = 0,6-0,8) induziert mit 1 mM IPTG. Führen Induktions für 2-3 Stunden bei 30 ° C unter Rühren. </li><li> Zentrifugenzellen (9.000 × g für 20 min) und Resuspension in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. </li><li> Stören Zellen mit einer Französisch Presse (10.000 psi, 4 Pass). Entsorgen ungebrochen Zellen und Einschlusskörper durch Zentrifugation bei 9.000 g für 20 min. </li><li> Pellet-Membranen 1 h bei 100.000 xg und resuspend jedes Pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 20% Glycerin (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl. </li><li> Bestimmung der Gesamtmembranproteinkonzentration unter Verwendung des BCA-kolorimetrischen Assay und Solubilisierung der Membranen O / N bei 2% Dodecylmaltosid (DDM) in einem Endvolumen bestimmt, so daß Reinigungsmittel: Protein 1:1,5 (w / w). </li><li> Ultrazentrifuge bei 100.000 g für 1 Stunde an nicht gelösten und aggregiertes Material verwerfen. </li><li> Inkubieren der Überstand für 2 Stunden bei 4 ° C mit einer Nickel-Harz (Mexa Reinigung) oder einer Kobalt-Harz (MexB Reinigung) mit Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% Glycerin äquilibriert (w / v), 10 mM Imidazol, NaCl 500 mM, DDM 0,2%. </li><li> Gießen Sie den Harz in einer leeren Spalte. Sammeln Sie die Flow-Through. </li><li> Waschen des Harzes mit 50 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 20% Glycerin (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl, DDM 0,2%, dann mit 25 ml Bis-Tris 10 mM pH 6, Glycerin 5% (w / v), 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 0,2% DDM. </li><li> Eluiere das protein mit 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% Glycerin (w / v), 300 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 0,2% DDM. </li><li> Konzentrieren des Proteins mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung auf 3 ml und Belastung einer Entsalzungssäule mit einem Imidazol-freiem Puffer äquilibriert. Kurz vor der Rekonstitution (siehe unten), Ultrazentrifugation der solubilisierten Proteine ​​(100.000 × g für 20 min), um von Lipiden und Proteinen unsolubilisierte loszuwerden. Dann konzentrieren, die das Protein wieder in 0,3 ml. </li></ol></li><li> Bakteriorhodopsin aus Halobacter salinarium <ol><li> Wachsen Halobacter salinarium Zellen unter Beleuchtung bei 37 ° C für 10 Tage in einem flüssigen Wachstumsmedium, das 4 M NaCl, 150 mM MgSO 4, 10 mM Citrat, 30 mM KCl, Hefeextrakt 5 g / l Pepton 5 g / L. </li><li> Stören Zellen durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser. </li><li> Reinige den Purpurmembran auf einem 30-40% (w / v) Saccharosegradienten (100.000 × g für 17 h). </li><li> Solubilisierung des Membransuspension mit 2% octylglucoside für 24 h bei 37 ° C (Volumen für die Solubilisierung, um die Membran bei einer 2:1 (w / w) Waschmittel resuspendieren: Protein-Verhältnis). Schätzen Sie die Konzentration der gelösten BR mit ε (570 nm) = 54000 M -1 cm -1. Kurz vor der Rekonstitution (siehe unten), Ultrazentrifugation des solubilisierten BR (100.000 × g für 20 min), um von Lipiden und Proteinen unsolubilisierte loszuwerden. Hinweis: Die nativen Membranen sind natürlich in BR angereichert, so dass keine weitere Reinigung erforderlich ist. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Proteo <ol><li> Liposomenbildung: Setzen 400 ul DOPC in Chloroform (25 mg / ml), gelöst in einem Becherglas und füge 1,5 mg Cholesterin als Pulver gelagert. Trocknet sie kurz vor Manipulation unter einer Stickstoff-oder Dampfdruck von mindestens 1 Stunde in einem Becherglas. Die DOPC-Cholesterin-Stoffmengenverhältnis 3,3:1. <ol><li> Nachdem sie getrocknet wurden, hydratisieren die Lipide mit 1 ml 25 mM HEPES pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM Pyranin. Die Suspension sollte in diesem Stadium trüb erscheinen. </li><li> Die Lösung wird für 10 min bei 37 ° C. Beschallen für 10 min bei 40 W mit 30 sec Puls, 30 s Pause Zyklen bei RT. Die Suspension sollte in dieser Phase klar erscheinen. </li><li> Um eine monodisperse Population von Liposomen zu erhalten, führen Sie zwei Zyklen der Extrusion und für jeden Zyklus, vorbei an der Liposomensuspension durch den Filter mindestens 11x. Für den ersten Zyklus, verwenden eine Membranporengröße von 200 nm und für den zweiten Zyklus, verwenden eine Membranporengröße von 100 nm auf. Dynamische Lichtstreuungsmessungen kann bei diesem Schritt durchgeführt, um die Homogenität der Suspension zu überprüfen. </li></ol></li><li> Protein-Aufnahme Prinzip: Membranproteine ​​können in Liposomen dank der machende Wirkung von Reinigungsmitteln aufgelöst werden. Detergens-solubilisierten Liposome mit dem Detergens-solubilisierten Membranproteins und die Bildung der p inkubiertroteoliposomes wird durch schnelle Beseitigung der Reinigungsmittel mit Polystyrol-Kügelchen 9 ausgelöst. <ol><li> In 28 mg Triton X-100 (0,56% endg.) und Inkubation O / N bei 4 ° C (der Solubilisierung Temperatur auf das Protein untersucht, angepasst werden). </li><li> Hinzufügen des Detergens-solubilisierten Protein (BR, MexB und Mexa) mit den Liposomen solubilisiert und Inkubation 15 min bei 4 ° C. Hinzufügen der Proteine ​​an solubilisierten Liposomensuspension in den folgenden Verhältnissen (w / w): Lipide / MexB = 20, MexB / Mexa = 2,5 und Lipide / BR = 30. </li><li> In Polystyrol-Kügelchen auf einen 30:1-Perlen: Reinigungsmittel-Verhältnis (w / w, wenn man bedenkt, das Gesamtgewicht des Reinigungsmittels, einschließlich Reinigungsmittel mit den gereinigten Proteinen aufgenommen) und Inkubation 5 Stunden, in der Dunkelheit (wegen der BR) bei RT unter leichtem Rühren. Vor dieser Prozedur, aktivieren Sie die BioBeads mit Methanol und Ethanol Inkubation und ausgiebig mit Wasser zu waschen. </li><li> Reinige den Proteo Protein und freien Substraten unter Verwendung einer PD-10Entsalzungssäule mit 25 mM HEPES pH 7, K 2 SO 4 äquilibriert, 100 mM MgCl 2 und 2 mM. </li><li> Bewahren Sie die Proteo bei 18 ° C in der Dunkelheit für bis zu 2-3 Wochen. </li></ol></li><li> Bewertung der Wirksamkeit der Rekonstitution auf Saccharosegradienten. Um zu überprüfen, dass sowohl die MexB und der BR in Liposomen rekonstituiert wurde, reinigen das Proteoliposom Suspension auf einem diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten. <ol><li> Die Proteo Sanft setzen sich auf einem Fünf-Schicht-Gradienten von Saccharose (60%, 20%, 10%, 5% und 2,5%, w / v). </li><li> Ultrazentrifuge für 17 h bei 100.000 xg (mit minimalen Beschleunigungs-und Verzögerungsraten). </li><li> Sorgfältig sammeln die verschiedenen Gradientenfraktionen (insbesondere die Schnittstellen zwischen jeder Schicht von Saccharose) und unter Verwendung von Coomassie-Färbung oder Western-Blot analysiert werden auf SDS-PAGE (10%). Aggregierten Proteine ​​werden an der Unterseite des Rohres festgestellt, während nonincorporated, Waschmittel-solubilisierten Proteine ​​werden an der Spitze gefundendas Rohr. Proteo und Liposomen werden in Saccharose-Schnittstellen, die ihre Eigendichte entsprechen gefunden. Leere Liposomen werden weiter oben in der Steigung als die Proteo erholt. </li></ol></li></ol> 3. Fluoreszenzmessung <ol><li> Fluoreszenzmessungen durchzuführen bei 25,0 ° C mit einem Spektrofluorometer, so dass für Dual-Wellenlängen-Messungen (Xe-Lampe, 150 W). Alternative Beleuchtungsperioden (BR mit Anregungs / Emissionswellenlängen von 550 nm / 550 nm zu aktivieren) und Fluoreszenzmessungen mit Anregungs / Emissionswellenlängen von 455 nm / 509 nm für 2 Sekunden, um die Fluoreszenz zu messen Pyranin. Einstellen der Anregungs-und Emissionsbandbreiten bis 5 nm aufweist. Führen die Messungen in der Anwesenheit von 50 nM Valinomycin, um die Bildung einer umgekehrten Membranpotential ΔΨ zu verhindern. Anmerkung: In der Tat, da der BR Protonen-Pumpen gibt es mehr positive Ladungen innerhalb der Liposomen als außerhalb. Diese GebührGradienten können mit Valinomycin verworfen werden, was eine selektive K +-Ionophor ist. Sobald auf die Liposomen-Suspension zugesetzt Valinomycin, ein hydrophobes Molekül, in die Liposomenmembran einzusetzen, passiv transportiert K +, und somit das Membranpotential abzuleiten ΔΨ. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bestimmung der Rekonstitution Membranproteintransport konzipiert. Einmal eingerichtet, führt das Protein Rekonstitution Messungen, die sehr reproduzierbar sind. Allerdings werden die genauen Bedingungen für die Rekonstitution des Proteins aus einem Protein zum anderen variieren. Viel Sorgfalt muss bei der Optimierung die folgenden Parameter beachtet werden: i) Qualität der Reinigung (Reinheit und Abwesenheit von aggregierten Material), ii) die Effizienz der Reinigungsmittel Solubilisierungsschritt (wenn möglich, niedrige cmc Reinigungsmittel bevorzugt werden, weil sie leichter zu bekommen der) zu befreien; iii) Desorption des Waschmittels (es ist beispielsweise möglich, die Verwendung von Polystyrolkügelchen mit einem Dialyseschritt zu kombinieren, aber dies kann die Geschwindigkeit der Desorption, ein kritischer Parameter für die anschließende Aktivität des Proteins beeinflussen, siehe Lit. [ 9]), iv) Wieder Lipid (die chemische Natur des Lipids, das Lipid zu Protein-Verhältnis, in Gegenwart einer zusätzlichen amphiphiles sind kritische Parameter, die verändert werden müssen und optimiert). Neben Temperatur und Inkubationszeit wirken sich auf alle diese Fragen. Die Qualitätskontrolle ist bei jedem Schritt der Rekonstitution so Ur. Von diesem Standpunkt aus gesehen, ist die Lichtstreuung eine sehr geeignete Technik, da sie eine schnelle, zerstörungsfreie und erfordert nur 20 ul der Probe bei einer Konzentration im mikromolaren Bereich. Sobald die Proteo gebildet werden, ist Saccharose-Gradienten auch eine große Hilfe, weil es den Weg in Richtung einer systematischen Überprüfung der Rekonstitution: qualitative (wird das Protein tatsächlich in der Liposomenmembran eingebettet) als auch quantitative (wie viele Protein in ein Liposom). Letzteres wäre durch die genaue Messung der Protein-und Lipidkonzentrationen behandelt werden. Unser Test nicht auf die Titration des Substrats selbst vertrauen und dies vermeidet unruhig Überlegungen zu möglichen Artefakt passive Diffusion von<html> das Molekül durch hydrophobe Partitionierung in den Membranen. Der Test nutzt Eigenschaften der Pyranin als zuverlässiger und quantitative Sonde zur Überwachung von pH-Änderungen. Unsere Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den Ergebnissen mit einem anderen Verfahren, bei dem Protonengradienten Bildung wurde mit Valinomycin 10 erhalten, aber es ermöglicht eine robuste und reproduzierbare Farbverlauf 11. Darüber hinaus kann die Protonengradienten genau abgestimmt werden, einfach durch Variieren der Konzentration des Puffers (für weitere Einzelheiten siehe Verchere et al. 12). In dem Verfahren wird eine Kontrollmessung zunächst in Abwesenheit des Substrats durchgeführt (dies ermöglicht den Zugang zu dem passiven Aktivität des Proteins). Die tatsächliche Membranprotein-Transporteraktivität wird gemessen, nachdem das Substrat in die gleiche Küvette hinzugefügt. Das ist wirklich ein Vorteil, weil das Experiment kann als eine echte, nicht mehrdeutig, Substrat-induzierte Ergebnis berücksichtigt werden. ent &quot;&gt; Das Protokoll könnte zu Hochdurchsatz-Medium (zum Beispiel 96-Mulden-Messungen) Automatisierung angepasst werden, da Beleuchtung der Probe löst die Reaktion. Automatisierung und Parallelisierung wäre in der Vorbereitung einen großen Stapel von Proteoliposom bestehen, und bei der Abgabe von Teilmengen in einer 96 Vertiefungen Platte. Substrate (und auch Inhibitoren) dann zugesetzt werden und nach der Inkubation in der Dunkelheit für 45 min wird die Platte, den Beleuchtungs / Pyranin Fluoreszenzmesszyklen auf einem Mikroplattenlesegerät unterzogen werden. Für weitere Informationen zu dem Protokoll werden die Leser aufgefordert, Verchere et al lesen. 12,13

Integrale Membranproteine ​​machen bis zu 30% der Gene in eukaryotischen Genomen codiert. Sie teilen zentrale Rollen wie gate keeping (Rezeptoren), Transportieren Nährstoffe, Ionen oder schädliche Verbindungen (Transporter) oder die Aufrechterhaltung der Durchlässigkeit über die Membran-Doppelschichten (Kanäle) unter allen lebenden Zellen ein. Efflux-Pumpen haben eine zentrale Rolle bei der Resistenz gegen Antibiotika-Therapie zwei. Die an der Gram-negativen Bakterien Pseudomonas aeruginosa, die von einer äußeren Membran geschützt ist, werden Effluxtransporter als dreiseitige Systeme, bei denen MexB die Abflusspumpe in der inneren Membran befindet, arbeitet in Verbindung mit Mexa, einem periplasmatischen Protein und OprM, eine organisierte Außenmembran-Kanal. Die cytoplasmatische inneren Membranprotein wirkt als energieabhängige Pumpe mit breiter Substratspezifität. Das äußere Membranprotein fungiert als Porin während die dritte ist in den periplasmatischen Raum und ist gedacht, um den Komplex zu stabilisieren, <sbis&gt; 3. Im folgenden konzentrieren wir uns auf die Gestaltung eines funktionellen Assay für die Mexa MexB Anordnung. Strukturelle Informationen über die letzten 5 Jahre dank der X-ray Bestimmung der homologen Protein aus Escherichia coli AcrB 4-7 angesammelt. Zwar ist es zweifellos wichtig zu koppeln diese Informationen mit dynamischen und kinetischen Daten, die Gestaltung eines funktionellen Assays für dieses Transporters ist eine echte Herausforderung 8. In der Tat muss die Membranproteine ​​in einer membranartigen Umgebung gehalten werden, und ein geschlossenes Fach ist eine vektorielle Transport des Substrats erreicht werden beibehalten werden. Rekonstitution von Membranproteinen in Proteo wurde ausführlich vorgestellt und bewertet (siehe Rigaud und Levy 9). Solche Protokolle ermöglichen die Überwachung von Membranproteinen Aktivität, beispielsweise durch die folgenden Substrate durch die Liposomenmembran. In diesem Fall Einschränkungen ergeben sich aus der einV erfügbarkeit titrierbare Substrate (fluoreszierend, radioaktiv, etc.) und aus der Tatsache, dass sehr oft diese Substrate sind hydrophob und haben eine Tendenz, Membranen unabhängig von der Anwesenheit des Transporters zu überqueren. Als Alternative kann man die spektroskopische Variationen eines Berichts Farbstoff empfindlich auf chemische Veränderungen, die infolge des Transports auftreten, zu folgen. Wie oben angegeben, Protonen Energie Transport über MexB. Daher ist eine entsprechende Option, um die spektroskopischen Variationen eines pH-sensitiven Farbstoff Berichts pH-Schwankungen durch Protonen-Substrat-Transport angetrieben folgen überwachen. Die Auswahl eines fluoreszierenden Farbstoffes vermeidet Artefaktwirkungen aufgrund der hydrophoben Natur des Substrats. Eine weitere Schwierigkeit ist die Erzeugung eines Protonengradienten. Mehrere Protokolle können in der Literatur gefunden werden. Unter diesen ist die Verwendung von Valinomycin Technik weit verbreitet, aber wir haben gezeigt, dass es mühsam, 10-11 auszuführen. Darüber hinaus ist esnicht reproduzierbar und ist nicht reversibel. Wir haben uns auf die Verwendung von Bakteriorhodopsin (BR), einem lichtaktivierten Protonenpumpe von Halobacter salinarium, einem halophilen marinen Gram-negative obligat aerobe Archaeons gegriffen. Dieses Protein wird in Liposomen mit MexB coreconstituted und bei Beleuchtung, BR-Pumpen Protonen im Inneren der Liposomen und damit schafft die ApH (sauer innen) durch das Protein benötigt, um das Substrat 12-13 transportieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

Es ist eine neue wissenschaftliche Notwendigkeit für zuverlässige Werkzeuge für die Überwachung von Membranproteintransport. Wir präsentieren eine Methode, die zur Wiederherstellung der Austausch-Pumpen aus dem Gram-negativen Bakterien Pseudomonas aeruginosa in einer biomimetischen Umgebung, die für eine genaue Untersuchung ihrer Aktivität von Transport ermöglicht. Drei Voraussetzungen erfüllt sind: Kompartimentierung in einer Lipidumgebung, die Verwendung eines entsprechenden Index für den Transport, und die Erzeugung eines Protonengradienten. Die Membranproteintransporter in Liposomen mit Bakteriorhodopsin eines lichtaktivierten Protonenpumpe, die einen Protonengradienten, die sowohl robust als auch reversibel und abstimmbar ist erzeugt rekonstituiert. Die Aktivität des Proteins wird von den pH-Schwankungen im Liposom auftretenden abgeleitet, mit Pyranin, eine pH-abhängige Fluoreszenzsonde. Wir beschreiben eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, bei dem Membranproteinreinigung, Liposomenbildung, Protein-Rekonstitution und Transport einnalyse angesprochen. Obwohl sie speziell für ein RND-Transporter entwickelt, könnten die beschriebenen Verfahren möglicherweise für die Verwendung mit einem anderen Membranprotein-Transporter von einem Protonengradienten erregt angepasst werden.

Der Test besteht aus der Überwachung Pyraninmarkiertes Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit während eine Protonengradienten erzeugt. Zu diesem Zweck werden Proben alternativ Beleuchtungs (daher Protonenpumpen vom BR ausgelöst wird) unterzogen und dann einer Messung der Fluoreszenz unter Verwendung von Anregungs-und Emissionswellenlängen von Pyranin (λ ex = 455 nm und λ em = 509 nm). Figur 1 zeigt ein repräsentatives Steuer mit dem Assay erhaltenen, in Abwesenheit von Mexa / MexB, Verifizieren, dass das Protonengradienten durch die BR erzeugt ist reversibel. Nach einem Zyklus von Versauerung, sind Proteo im Dunkeln für 45 min, damit der BR gehalten zu stoppen Pumpen Protonen (Protonen nach ihrem Konzentrationsgefälle diffundieren langsam und passiv durch Lipiddoppelschichten). Nach dieser Erholungszeit ist die Aktivierung von BR möglich, einfach durch die Beleuchtung die gleiche Suspension wieder. Figur 2entspricht einer tatsächlichen Verkehrsmessung. Eine negative Kontrolle mit Protein-freien Liposomen zeigt, dass, wie erwartet, bei konstanter Beleuchtung (Fig. 2A und 2B, orange Kreise) ist der pH-Wert. Jedoch Proteo enthaltenden BR in ihren Membranen keine Protonenpumpe, wodurch der pH-Wert im Inneren der Liposomen ab, und ein stabiler Gradient aufgebaut ist (Fig. 2A und 2B, lila Quadrate). Graue Dreiecke und roten Diamanten (2A) darstellen pH Innenseite Proteo BR und MexB enthält, in Gegenwart oder in Abwesenheit von Hoechst 33342, auf. Wir beobachten eine Substrat-unabhängige Aktivität, wo der Protonen-Gradient wird nur teilweise durch MexB Gegenverkehr abgebaut. Wir führen diese Beobachtung auf eine basale Aktivität MexB. Um die Wirkung der Mexa auf die Aktivität MexB testen, Mexa wurde der Rekonstitution zuerst in Abwesenheit von Substrat (hinzugefügt, <strong&gt; 2B, blaue Diamanten). Wiederum wird die Protonengradienten durch die BR erzeugt nur teilweise abgebaut. Der eigentliche Transport Messung basiert auf der gleichen Probe realisiert. Zuvor muss der Protonengradienten neu initialisiert werden, und das Substrat muss in der Suspension, um seine Bindungsstelle im Protein erreicht zugesetzt werden. Zu diesem Zweck wird die Suspension in der Dunkelheit in Gegenwart des Substrats für 45 Min. inkubiert. Beim nachfolgenden Beleuchtungs, kann man sehen, dass die Protonengradienten durch die BR erzeugt wird nun vollständig durch MexAB (2B, grüne Dreiecke) abgeführt wird, als Folge der durch die Substrattransportpumpe. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . Abbildung 1 Reversibilität der Protonengradienten durch BR-Beleuchtung gebaut: Pyranin fluorescence BR Proteoliposomen, gemessen als eine Funktion der Zeit. Von 0-15 min, BR-Pumpen Protonen als Folge der Lichtaktivierung. Von 15 bis 60 min, sind Proteo im Dunkeln inkubiert, während dieser Zeit, Protonen passiv aus den Liposomen bewegen, bis der pH-Wert und intravesikulären extravesikulären pH-Wert gleich sind. Von 60 bis 75 min, BR ist noch funktionsfähig und Pumpen Protonen bei Beleuchtung. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . Figur 2 Transport-Assay: Pyraninmarkiertes Fluoreszenz, in das entsprechende pH-Schwankungen als Funktion der Zeit A) pH-Wert innerhalb der Kontrollliposomen (orange Kreise), pH-Wert innerhalb von Proteo BR in der Membran (lila Quadrate) enthält, pH innen. von Proteo enthalten BR und MexB in der Membran ohne Hoechst 33342 (rot diamonds), pH-Wert innerhalb von Proteo enthalten, BR und MexB in der Membran mit Hoechst 33342 (graue Dreiecke) B) pH-Wert innerhalb des Steuer Liposomen (orange Kreise);. pH-Wert innerhalb von Proteo enthalten BR in der Membran (lila Quadrate), pH-Wert innerhalb von Proteo enthalten BR, MexB und Mexa in der Membran ohne Hoechst 33342 (blaue Diamanten), pH-Wert innerhalb von Proteo enthalten, BR, MexB und Mexa in der Membran mit Hoechst 33342 (grüne Dreiecke).

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In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Wir stellen ein Protokoll für die in vitro Untersuchung der Effluxpumpen von Pseudomonas aeruginosa. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung eines robusten, reversibel und abstimmbare Protonengradienten in der Liposomenmembran und daher sollte anpassungsfähig an jede Membranprotein vom protomotive Kraft erregt werden.

In-vitro-Untersuchung der MexAB Effluxpumpe Von Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K Aufrufe.  CNRS & Université Paris Descartes.  Wir stellen ein Protokoll für die in vitro Untersuchung der Effluxpumpen von Pseudomonas aeruginosa. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung eines robusten, reversibel und abstimmbare Protonengradienten in der Liposomenmembran und daher sollte anpassungsfähig an jede Membranprotein vom protomotive Kraft erregt werden. 

Serie: In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Forschung

Biologie

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie zur Untersuchung von Metaboliten in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Wurzelknöllchen

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Untersuchung des Zinktransportmechanismus in Säugetierzellen mit dem FluoZin-3-Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der zellulären Zinkregulation durch ZnT1-Funktionalität 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...