Das SNF-Stipendium 310030_219210 an J.H.N. unterstützte die Veröffentlichung dieses Manuskripts ohne Einschränkungen. Abbildung 1 wurde mit Hilfe von BioRender.com erstellt.

Die Verfahren wurden von der Ethikkommission der Nordwest- und Zentralschweiz (EKNZ; Projekt-ID 2019-00273). Alle Patienten gaben vor der endoskopischen Untersuchung eine schriftliche Einverständniserklärung für den experimentellen Einsatz von Biopsien ab. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Zellisolierung von patienteneigenen Organoiden der Speiseröhre
ANMERKUNG: Eine Liste der Bestandteile des Mediums für die Kultivierung humaner Organoide der Speiseröhre ist in Tabelle 1 enthalten.
<ol><li>Besorge dir die Biopsien. HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden zwei Biopsien aus einem Speiseröhrensegment während der Ösophagogastroduodenoskopie mit einer Biopsiezange unter Verwendung eines Gastroskops mit einem 2,8-mm-Arbeitskanal gewonnen.</li>
	<li>Überführen Sie die Biopsien in ein kommerziell erhältliches keratinozytenserumfreies Medium (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). HINWEIS: Biopsien können bis zur Verwendung mehrere Stunden auf Eis gelagert werden.</li>
	<li>Ersetzen Sie das KSFM-Medium durch 1 mL Dispase I (10 U/mL) und inkubieren Sie die Biopsien 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Dispase mit einer 1000-μl-Pipette, ohne die Biopsien und das Pellet der Zelltrümmer zu berühren.</li>
	<li>Spülen Sie die Biopsien mit 1 mL Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Biopsien mit 500 μl Trypsin-EDTA (0,05%) bei 37 °C für 10 min und schütteln Sie bei 800 U/min.</li>
	<li>Führen Sie den mechanischen Aufschluss durch wiederholtes Auf- und Ab-Pipettieren durch, bis eine einzellige Suspension erhalten wird.</li>
	<li>Filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb mit dem Gummikolbenkopf einer Tuberkulinspritze.</li>
	<li>Waschen Sie das Sieb mit 2-4 mL Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (250 μg/mL).</li>
	<li>Filtern Sie die Zellen durch ein 35-μm-Zellsieb mit einer Schnappkappe auf einem 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.</li>
	<li>Übertragen Sie die einzellige Lösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl KSFM-Medium.</li>
	<li>Mischen Sie 10 μl Trypanblau mit 10 μl Zellsuspension.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.</li>
</ol>2. Vom Patienten stammende Organoidkultur
<ol><li>Geben Sie nach der Zählung 1-2 ml KSFM in die Zellsuspension.</li>
	<li>Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000 μL-Pipette, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in einer Hydrogel-Matrix aus Basalmembranextrakt (BME) (40 μl BME pro 20.000 Zellen). HINWEIS: Halten Sie die Zellen nach der Zugabe des BME auf Eis, um eine vorzeitige Verfestigung des BME zu verhindern.</li>
	<li>Schneiden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze ab, um das viskose BME-Zell-Suspensionsgemisch abzusaugen.</li>
	<li>Bilden Sie 40 μl Tröpfchen in einer vorgewärmten (37 °C) Suspensionszellkulturplatte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte ohne Medium für 20-30 min bei 37 °C, um eine Verfestigung der BME-Tröpfchen zu gewährleisten.</li>
	<li>In den ersten beiden Kulturtagen wird vorgewärmtes KSFM-C-Medium, das mit 10 μM Y27632 (ROCK-Inhibitor) ergänzt wird, zugegeben.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch ein neues KSFM-C-Medium (ohne Y27632 und +/- Zytokin von Interesse).</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium und kratzen Sie die Tröpfchen mit der Pipettenspitze ab, während Sie kontinuierlich 1 ml Dispase II (1,5 U/ml) in die Vertiefung geben.</li>
	<li>Das BME-Dispase-Gemisch in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen und 20 min bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad inkubieren, um das BME zu verdauen.</li>
	<li>Bei 250 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren und die Dispase II aspirieren.</li>
	<li>Gehen Sie gemäß dem Protokoll der Interessenauslesung vor (z. B. RNA-Isolierung, Proteinisolierung oder Fixierung mit 4 % PFA für die Histologie).</li>
</ol>3. Zellisolierung für vom Patienten stammende Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen (ALI)
<ol><li>Besorge dir die Biopsien. Bei der Ösophagogastroduodenoskopie mit einem Gastroskop mit einem 2,8-mm-Arbeitskanal werden mit einer Biopsiezange zwei Biopsien aus einem Speiseröhrensegment entnommen.</li>
	<li>Geben Sie die Biopsien in ein kommerziell erhältliches keratinozyten-serumfreies Medium (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) und bis zur Verwendung mehrere Stunden auf Eis lagern.</li>
	<li>Tauschen Sie KSFM durch 1 mL Dispase (10 U/mL) aus. Inkubieren Sie die Biopsien anschließend 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Biopsien bei Raumtemperatur bei 300 x g für 2 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dispase mit einer 1000-μl-Pipette, ohne die Biopsien und das Pellet der Zelltrümmer zu berühren.</li>
	<li>Waschen Sie die Biopsien mit 1 mL DPBS.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur die Biopsien bei 300 x g für 2 min herunterschleudern.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand mit einer 1000-μl-Pipette.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Biopsien in 500 μl Trypsin-EDTA (0,05%) bei 37 °C für 10 min und mischen Sie sie während der Inkubation kontinuierlich bei 800 U/min.</li>
	<li>Unterbrechen Sie die Biopsien mechanisch durch wiederholtes Auf- und Ab-Pipettieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wird.</li>
	<li>Führen Sie die dissoziierten Zellen durch ein 70 μm Zellsieb mit einem Gummikolbenkopf aus einer Tuberkulinspritze und sammeln Sie die Zellen in einem konischen 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie das Sieb mit 2-4 mL Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (250 μg/mL), um die restlichen Zellen aus dem Sieb zu entfernen.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellen mit einem 35-μm-Zellsieb-Schnappverschluss in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Bei 300 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand mit einer 1.000-μl-Pipette.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 mL KSFM-Medium (Ca2+ 0,09 mM), einschließlich 10 μM Y27632.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in einen T25-Zellkulturkolben.</li>
	<li>Um die primären Keratinozyten zu erweitern, kultivieren Sie die Zellen etwa 1 Woche lang bis zu 60%-80% Konfluenz. HINWEIS: Passage (P)0 bildet inselartige Zellkonglomerate und ist keine Monoschicht. Primäre Keratinozyten bilden ab P1 Monoschichten.</li>
	<li>Passage bei 60 %-80 % Konfluenz und erneute Aussaat von P1 in 2-3 T25 oder 1-2 T75 Zellkulturflaschen.</li>
	<li>Wieder Passage P1, wenn Keratinozyten eine Monoschicht mit 60%-80% Konfluenz bilden.</li>
</ol>4. Vom Patienten stammende Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur (ALI)
<ol><li>Säen Sie primäre P2-Keratinozyten auf Transwell-Inserts für die ALI-Kultur. HINWEIS: 400.000 Zellen in 12 Well-Inserts (200.000 Keratinozyten pro 0,6 cm2) in 500 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/ml BPE) aussäen.<ol><li>150.000 Zellen in 24 Well-Inserts (155.000 Keratinozyten pro 0,5 cm2) in 100 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) säen.</li>
		<li>Alternativ können Sie die gefrorenen Zellen im KSFM-Medium (Ca2+ 0,09 mM + 10 % DMSO) bei -80 °C für 24 h einfrieren und anschließend für die spätere Verwendung in flüssigen Stickstoff überführen. HINWEIS: Bei Verwendung von gefrorenen Fläschchen die Passage nach dem Auftauen erneut durchführen, bevor die Zellen für die ALI-Kultur verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie Medium in die untere Vertiefung unter dem Einsatz der Transwell-Kulturplatte. HINWEIS: Für 12-Well-Platten: 1,5 mL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). Für 24-Well-Platten: 600 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).</li>
	<li>Ersetzen Sie das mittlere bis hohe Kalzium KSFM (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) nach 2 Tagen.</li>
	<li>Wechseln Sie das kalziumreiche KSFM-Medium jeden zweiten Tag bis zum 7. Tag.</li>
	<li>Führen Sie an Tag 7 einen Lufttransport durch, indem Sie das Medium aus der oberen Kammer ansaugen und das Medium in der unteren Kammer durch KSFM mit hohem Calciumgehalt (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) mit 10 ng/mL KGF (= FGF7), 75 μg/mL Ascorbinsäure (AA) ersetzen.<ol><li>Optional: Geben Sie das gewünschte Zytokin in der gewünschten Konzentration in das Medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag.</li>
</ol>5. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)
<ol><li>Sterilisieren Sie die Elektrode des TEER-Messgeräts, indem Sie sie 10-15 Minuten lang in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 5 % Natriumhypochlorit eintauchen.</li>
	<li>Waschen Sie das 5%ige Natriumhypochlorit ab, indem Sie die Elektrode in 4 aufeinanderfolgende Vertiefungen mit sterilem ddH2O eintauchen und die Elektrode an der Luft trocknen lassen.</li>
	<li>Setzen Sie den Rohling fest, indem Sie eine Elektrode in die Vertiefung und die zweite Elektrode in den Transwell-Einsatz einsetzen, ihn mit PBS füllen und den TEER messen. HINWEIS: Empfohlene Volumina für TEER-Messungen: Für 12-Well-Platten (1900 μl im Well und 900 μl im Einsatz). Für 24-Well-Platten (750-1000 μl im Well und 250 μl im Einsatz).</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium der ALI-Kulturen durch steriles PBS bei Raumtemperatur. HINWEIS: Entfernen Sie das Medium aus der unteren Vertiefung und in einem zweiten Schritt aus dem Transwell-Einsatz. Geben Sie PBS in ähnlicher Weise zuerst in den Einsatz und dann in die untere Vertiefung, um eine Ablösung der ALI-Kultur von der Transwell-Membran zu verhindern.</li>
	<li>Platzieren Sie die TEER-Meterelektroden in den Experimentiervertiefungen mit ALI-Kulturen und führen Sie die TEER-Messung1 durch. HINWEIS: Führen Sie TEER-Messungen jeden zweiten Tag durch, bevor das Medium gewechselt wird.</li>
</ol>6. Makromolekularer Fluss
<ol><li>Die FITC-Dextran (3-5 kDa) Stammlösung wird auf eine Arbeitskonzentration von 1 mg/ml verdünnt. HINWEIS: Schützen Sie FITC-Dextran immer vor Lichteinwirkung.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe mit abnehmender FITC-Konzentration (1000 μg/mL bis 0,25 μg/mL) als Standard für die Ablesung vor.</li>
	<li>Geben Sie 500 μl FITC-Dextran-Lösung (1 mg/ml) in die obere Kammer des Transwells und 1,5 ml Medium (+/- Zytokin von Interesse) in das untere Fach und stellen Sie die Platte in den Inkubator.</li>
	<li>Sammeln Sie 120 μl Medium aus dem unteren Fach zu den jeweiligen Zeitpunkten (z. B. 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min und 180 min).</li>
	<li>Pipettieren Sie Duplikate (50 μl/Well) jedes Zeitpunkts in eine schwarze, transparente 96-Well-Platte mit flachem Boden.</li>
	<li>Stimulieren Sie das FITC-Dextran bei 490 nm und lesen Sie die Emission bei einer Wellenlänge von 520 nm mit einem Plattenleser ab.</li>
	<li>Berechnen Sie die Menge des makromolekularen Flussmittels gemäß der Norm.</li>
</ol>

Human Esophageal Organoids and Air-Liquid Interface Culture Protocols

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die zur Verfügung gestellten Verfahren ermöglichen die Kultivierung von patientengewonnenen Organoiden und ALI-Kulturen mit hohen Erfolgsaussichten. Das Organoid-Protokoll wurde aus dem ersten veröffentlichten Protokoll, das über die Erzeugung humaner Ösophagus-Organoide berichtet26, und aus einem kürzlich veröffentlichten Protokoll32 angepasst. Sherill und Kollegen haben das ALI-Modell22 beschrieben. Organoide und ALI-Kulturmodelle unterstüt...

Eine Entzündung der Speiseröhre beeinträchtigt die Integrität der Epithelbarriere 1,2,3,4,5, wie bei der eosinophilen Ösophagitis (EoE), einer Th2-dominierten chronischen Entzündungserkrankung der Speiseröhre6, beobachtet wird. EoE wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben 7,8 und wird überwiegend durch die Lebensmittelantigene 9,10,11,12,13 induziert. Die am häufigsten auftretenden Symptome von EoE in der erwachsenen Bevölkerung sind Dysphagie und Nahrungsmittelimpaktion14. Bei Kindern manifestiert sich EoE typischerweise mit Gedeihstörungen, Nahrungsverweigerung, Erbrechen und Bauchschmerzen15. Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben EoE-Risikogene identifiziert, die an der Integrität der Epithelbarriere beteiligt sind, wodurch das Epithel in den Fokus der EoE-Forschung gerücktist 16,17,18. Die EoE-Transkriptomik zeigte weiterhin, dass ein gestörter Differenzierungsprozess und eine reaktive Basalzonenhyperplasie die beeinträchtigte Barrierefunktion des Ösophagepithels verursachen 3,5,19,20,21,22. Das frühe Verständnis, dass EoE eine Th2-vermittelte Erkrankungist 6, führte zur Entdeckung von IL-13 als treibender Mediator durch Störung der epithelialen Integrität 3,4,21,23. Experimentelle Systeme, die es ermöglichen, Zytokin-vermittelte Effekte auf die Epithelintegrität von intrinsischen Barrierebeeinträchtigungen durch genetische Prädisposition zu disparieren, bieten die Möglichkeit, das komplexe Zusammenspiel zwischen Immunzellen und Epithel in EoE zu untersuchen. Humane Ösophagus-Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) wurden als wertvolle Werkzeuge vorgeschlagen, um die Auswirkungen der Zytokinstimulation auf die epitheliale Integrität zu analysieren5.
Das erste Protokoll zur Generierung adulter gewebespezifischer Stammzellen (ASC)-abgeleiteter Ösophagus-Organoide wurde fünf Jahre nach den ersten veröffentlichten Berichten über Darmorganoide im Jahr 2009 etabliert, bei denen intestinale Lgr5+-ASCs verwendet wurden, die das Epithelkompartiment des Dünndarms rekapitulieren24. DeWard et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Organoiden aus murinen Ösophagus-Epithelzellen25. Im Jahr 2018 erzeugten Kasagi et al. humane Ösophagus-Organoide aus der immortalisierten humanen Plattenepithelzelllinie EPC2-hTERT und primären patienteneigenen Zellen26. Im selben Jahr gelang es Zhang et al., aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Organoide der Speiseröhre zu erzeugen. Sie skizzierten die Bedeutung der Hemmung von TGFβ und knochenmorphogenetischem Protein (BMP) für die Entwicklung von Vorläuferzellen der Speiseröhre (EPC) und die entscheidende Rolle des Notch-Signalwegs bei der Differenzierung des geschichteten Plattenepithels26,27. Trisno und Kollegen ergänzten diese Befunde, indem sie Sox2 als Wnt-Inhibitor identifizierten, der das Entwicklungsschicksal in Richtung Ösophagusdifferenzierung lenkt28. Die anschließende Verfeinerung der Protokolle, der Zusammensetzung des Mediums und der Kulturbedingungen erhöhte die Organoidbildungsrate und ermöglichte die Subkultivierung und Rückgewinnung von Organoiden nach der Kryokonservierung 26,29,30,31,32. Obwohl diese Organoide leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Gewebearchitektur und der Expression potenzieller Zielgene nach Stimulation mit Zytokinen sind, bieten Organoide der Speiseröhre nicht die Möglichkeit, den transepithelialen Widerstand (TEER) oder den Makromolekülfluss als direkte Messungen für die Barriereintegrität zu messen. Wie zuvor von Sherrill und Kollegen22 beschrieben, ermöglichen ALI-Kulturen, die die epitheliale Differenzierung4 modellieren, eine direkte Beurteilung der epithelialen Integrität. Die Kombination von patienteneigenen Organoiden und ALI-Kulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Gewebearchitektur und der Integrität der Epithelbarriere bei EoE.
Hier finden Sie Verfahren mit Anweisungen zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus Ösophagusbiopsien und zur Etablierung von Organoid- und ALI-Kulturen der Speiseröhre, die weiter verwendet werden können, um die Auswirkungen von Zytokinen auf die Integrität der Barriere zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis

Das Plattenepithel der Speiseröhre ist direkt der Umwelt ausgesetzt und ständig fremden Antigenen, einschließlich Lebensmittelantigenen und Mikroben, ausgesetzt. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Epithelbarriere ist entscheidend für die Vorbeugung von Infektionen und die Vermeidung von Entzündungen, die durch harmlose Antigene aus der Nahrung verursacht werden. Dieser Artikel enthält vereinfachte Protokolle für die Generierung von humanen Organoiden der Speiseröhre und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen aus Patientenbiopsien, um das epitheliale Kompartiment der Speiseröhre im Zusammenhang mit Gewebehomöostase und -krankheit zu untersuchen. Diese Protokolle waren in den letzten zehn Jahren bedeutende wissenschaftliche Meilensteine und beschreiben dreidimensionale organähnliche Strukturen aus patientengewonnenen Primärzellen, Organoiden und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen. Sie bieten die Möglichkeit, die Funktion spezifischer Zytokine, Wachstumsfaktoren und Signalwege im Ösophagepithel in einem dreidimensionalen Rahmen unter Beibehaltung der phänotypischen und genetischen Eigenschaften des Spenders zu untersuchen. Organoide liefern Informationen über die Mikroarchitektur des Gewebes, indem sie das Transkriptom und Proteom nach Zytokinstimulation bewerten. Im Gegensatz dazu ermöglichen Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen die Beurteilung der Integrität der epithelialen Barriere durch Messungen des transepithelialen Widerstands (TEER) oder des Makromolekülflusses. Die Kombination dieser Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Forschung zu beeinträchtigten Bedingungen der epithelialen Barriere der Speiseröhre voranzutreiben.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis 

Organoide der Speiseröhre wachsen aus Primärzellen, die aus Patientenbiopsien gemäß den Anweisungen des bereitgestellten Protokolls extrahiert wurden, wie mit einem inversen Hellfeldmikroskop dokumentiert (Abbildung 1). Epithel-ASCs beginnen innerhalb der ersten zwei Tage der Kultur mit der selbstorganisierenden Bildung von Zellclustern, nachdem sie die isolierten Zellen in den Basalmembranextrakt eingesät haben, der als Gerüst dient. Die Größe und Anzahl der Zellcluster, die mit ein...

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Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von humanen Ösophagus-Organoiden und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen bereitgestellt. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur von Ösophagus-Organoiden kann verwendet werden, um den Einfluss von Zytokinen auf die Epithelbarriere der Speiseröhre zu untersuchen.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Wir untersuchen die Pathophysiologie der eosinophilen Ösophagitis und versuchen, die Entzündungskaskade zu entschlüsseln, die den chronischen Entzündungsprozess der EOE induziert und fördert. Die Identifizierung neuer Immunmediatoren, die zur Krankheitspathogenese beitragen, konzentrierte sich auf die Beeinträchtigung der Epithelbarriere und die Zulassung therapeutischer Antikörper gegen diese Immunmediatoren. Wir haben die Zytokine der IL-20-Unterfamilie als Entzündungsmediatoren identifiziert, die die epitheliale Differenzierung und Keratinisierung beeinträchtigen, was zu einer Beeinträchtigung der Epithelbarriere über den MAP-Kinase-Signalweg führt.

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Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

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461 Aufrufe.  University of Basel. Wir untersuchen die Pathophysiologie der eosinophilen Ösophagitis und versuchen, die Entzündungskaskade zu entschlüsseln, die den chronischen Entzündungsprozess der EOE induziert und fördert. Die Identifizierung neuer Immunmediatoren, die zur Krankheitspathogenese beitragen, konzentrierte sich auf die Beeinträchtigung der Epithelbarriere und die Zulassung therapeutischer Antikörper gegen diese Immunmediatoren. Wir haben die Zytokine der IL-20-Unterfamilie als Entzündungsmediatoren ide...

Serie: Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.