SNSF'nin J.H.N.'ye verdiği 310030_219210 no'lu hibe, bu el yazmasının herhangi bir kısıtlama olmaksızın yayınlanmasını destekledi. Şekil 1 , BioRender.com yardımıyla oluşturulmuştur.

Prosedürler Kuzeybatı ve Orta İsviçre etik komitesi (EKNZ; Proje Kimliği 2019-00273). Tüm hastalar endoskopik incelemeden önce biyopsilerin deneysel kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Hasta kaynaklı özofagus organoidleri için hücre izolasyonu
NOT: İnsan özofagus organoidlerinin kültürlenmesi için ortam bileşenlerinin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir.
<ol><li>Biyopsileri alın. NOT: Bu çalışmada, biyopsi forseps ile özofagogastroduodenoskopi sırasında 2.8 mm çalışma kanalına sahip gastroskop kullanılarak bir özofagus segmentinden iki biyopsi alınmıştır.</li>
	<li>Biyopsileri ticari olarak temin edilebilen keratinosit serumsuz ortama aktarın (KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). NOT: Biyopsiler kullanılana kadar birkaç saat buz üzerinde saklanabilir.</li>
	<li>KSFM ortamını 1 mL Dispas I (10 U / mL) ile değiştirin ve biyopsileri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Biyopsilere ve hücre kalıntısı peletine dokunmadan 1000 μL'lik bir pipet kullanarak Dispase'ı aspire edin.</li>
	<li>Biyopsileri 1 mL Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile durulayın.</li>
	<li>Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>1000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>Biyopsileri 500 μL Tripsin-EDTA (% 0.05) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca 800 rpm'de çalkalarken inkübe edin.</li>
	<li>Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleme yaparak mekanik bozulma gerçekleştirin.</li>
	<li>Bir tüberkülin şırıngasının kauçuk piston kafasını kullanarak hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Süzgeci 2-4 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü (250 μg/mL) ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri, 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüp üzerinde geçmeli kapaklı 35 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Tek hücreli çözeltiyi 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
	<li>300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>1000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>Hücreleri 100 μL KSFM ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>10 μL tripan mavisini 10 μL hücre süspansiyonu ile karıştırın.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.</li>
</ol>2. Hasta kaynaklı organoid kültür
<ol><li>Saydıktan sonra hücre süspansiyonuna 1-2 mL KSFM ekleyin.</li>
	<li>300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan süpernatanı 1000 μL'lik bir pipetle aspire edin.</li>
	<li>Hücre peletini Bodrum membran ekstraktı (BME) hidrojel matrisinde (20.000 hücre başına 40 μL BME) yeniden süspanse edin. NOT: BME'yi ekledikten sonra, BME'nin erken katılaşmasını önlemek için hücreleri buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Viskoz BME hücreli süspansiyon karışımını aspire etmek için 200 μL'lik bir pipet ucunu kesin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış (37 °C) bir süspansiyon hücre kültürü plakasında 40 μL damlacıklar oluşturun.</li>
	<li>BME damlacıklarının katılaşmasını sağlamak için plakayı 37 ° C'de 20-30 dakika besiyeri olmadan inkübe edin.</li>
	<li>Kültürün ilk iki günü için 10 μM Y27632 (ROCK inhibitörü) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış KSFM-C ortamı ekleyin.</li>
	<li>Ortamı her gün yeni KSFM-C ortamıyla (Y27632 ve +/- ilgilenilen sitokin olmadan) değiştirin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve kuyuya sürekli olarak 1 mL Dispase II (1.5 U / mL) eklerken pipet ucuyla damlacıkları kazıyın.</li>
	<li>BME-dispas karışımını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve BME'yi sindirmek için çalkalayan bir su banyosunda 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>4 ° C'de 3 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin ve Dispase II'yi aspire edin.</li>
	<li>İlgi okumasının protokolüne göre ilerleyin (ör., RNA izolasyonu, protein izolasyonu veya histoloji için% 4 PFA ile fiksasyon).</li>
</ol>3. Hastadan türetilen hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri için hücre izolasyonu
<ol><li>Biyopsileri alın. 2.8 mm çalışma kanalına sahip gastroskop kullanılarak özofagogastroduodenoskopi sırasında biyopsi forsepsleri ile bir özofagus segmentinden iki biyopsi alınır.</li>
	<li>Biyopsileri piyasada bulunan keratinosit serumu içermeyen ortama (KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) ve kullanıma kadar birkaç saat buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>KSFM'yi 1 mL Dispase (10 U/mL) ile değiştirin. Daha sonra biyopsileri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Biyopsilere ve hücre kalıntısı peletine dokunmadan 1000 μL'lik bir pipet kullanarak Dispase'ı çıkarın.</li>
	<li>Biyopsileri 1 mL DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında, biyopsileri 2 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.</li>
	<li>Süpernatanı 1000 μL'lik bir pipetle aspire edin.</li>
	<li>Biyopsileri 500 μL Tripsin-EDTA (% 0.05) içinde 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve inkübasyon sırasında 800 rpm'de sürekli karıştırın.</li>
	<li>Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar tekrarlanan yukarı ve aşağı pipetleme ile biyopsileri mekanik olarak bozun.</li>
	<li>Ayrışmış hücreleri, bir tüberkülin şırıngasından kauçuk bir piston kafası ile 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın.</li>
	<li>Süzgeçten kalan hücreleri çıkarmak için süzgeci 2-4 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü (250 μg/mL) ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 35 μm hücre süzgeci geçmeli kapakla 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpe süzün.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı 1.000 μL'lik bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Hücre peletini 10 μM Y27632 dahil olmak üzere 4 mL KSFM ortamında (Ca2+ 0.09 mM) yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri bir T25 hücre kültürü şişesine aktarın.</li>
	<li>Birincil keratinositleri genişletmek için, hücreleri yaklaşık 1 hafta boyunca% 60 -% 80 birleşene kadar kültürleyin. NOT: Geçiş (P)0, adacık benzeri hücre konglomeraları oluşturur ve tek katmanlı değildir. Primer keratinositler P1'den itibaren tek tabakalar oluştururlar.</li>
	<li>% 60 -% 80 birleşmede geçiş ve 2-3 T25 veya 1-2 T75 hücre kültürü şişelerinde P1'i yeniden tohumlayın.</li>
	<li>Keratinositler% 60 -% 80 birleşme ile bir tek tabaka oluşturduğunda tekrar P1 geçişi.</li>
</ol>4. Hastadan türetilen hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürü
<ol><li>ALI kültürü için P2 birincil keratinositlerini transwell eklere tohumlayın. NOT: 500 μL KSFM'de (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 12 kuyulu ekte (0.6cm2 başına 200.000 keratinosit) 400.000 hücre tohumlayın.<ol><li>100 μL KSFM'de (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 24 kuyucuklu ekte (0.5cm2 başına 155.000 keratinosit) 150.000 hücre tohumlayın.</li>
		<li>Alternatif olarak, KSFM ortamında (Ca2+ 0.09 mM + %10 DMSO) -80 °C'de 24 saat dondurun ve ardından donmuş hücreleri daha sonra kullanmak üzere sıvı nitrojene aktarın. NOT: Dondurulmuş şişeleri kullanırken, ALI kültürü için hücreleri kullanmadan önce çözüldükten sonra bir kez daha geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Transwell kültür plakasının ekinin altındaki alt kuyuya orta ekleyin. NOT: 12 oyuklu plaka için: 1,5 mL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). 24 kuyucuklu plaka için: 600 μL KSFM (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).</li>
	<li>Orta ila yüksek kalsiyumlu KSFM'yi (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 2 gün sonra değiştirin.</li>
	<li>Yüksek kalsiyumlu KSFM ortamını 7. güne kadar her iki günde bir değiştirin.</li>
	<li>7. günde, ortamı üst odadan aspire ederek ve alt odadaki ortamı 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL askorbik asit (AA) içeren yüksek kalsiyumlu KSFM (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) ile değiştirerek hava ikmali gerçekleştirin.<ol><li>İsteğe bağlı: Ortama istenen konsantrasyonda ilgilenilen sitokin ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ortamı 14. güne kadar her iki günde bir değiştirin.</li>
</ol>5. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü
<ol><li>TEER ölçüm cihazının elektrodunu, 10-15 dakika boyunca% 5 sodyum hipoklorit içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna daldırarak sterilize edin.</li>
	<li>Elektrodu steril ddH2O ile ardışık 4 kuyuya daldırarak ve elektrotun kurumasını sağlayarak %5 sodyum hipokloriti yıkayın.</li>
	<li>Bir elektrotu kuyuya ve ikinci elektrotu transwell ekine yerleştirerek, PBS ile doldurarak ve TEER'i ölçerek boşluğu ayarlayın. NOT: TEER ölçümleri için önerilen hacimler: 12 kuyulu plaka için (kuyuda 1900 μL ve ekte 900 μL). 24 kuyulu plaka için (kuyuda 750-1000 μL ve ekte 250 μL).</li>
	<li>ALI kültürlerinin ortamını oda sıcaklığında steril PBS ile değiştirin. NOT: Ortamı alt kuyudan ve ikinci adımda transwell ekinden çıkarın. Benzer şekilde, ALI kültürünün transwell membranından ayrılmasını önlemek için PBS'yi önce eke ve ardından alt kuyucuğa ekleyin.</li>
	<li>TEER metre elektrotlarını ALI kültürleri ile deney kuyularına yerleştirin ve TEER ölçümünügerçekleştirin 1. NOT: Ortam değiştirilmeden önce her iki günde bir TEER ölçümleri yapın.</li>
</ol>6. Makromoleküler akı
<ol><li>FITC-Dextran (3-5 kDa) stok çözeltisini çalışan 1 mg / mL konsantrasyona seyreltin. NOT: FITC-DEXTRAN'ı her zaman ışığa maruz kalmaktan koruyun.</li>
	<li>Okuma için standart olarak azalan FITC konsantrasyonuna (1000 μg/mL ila 0.25 μg/mL) sahip bir seyreltme sırası hazırlayın.</li>
	<li>Transwell'in üst bölmesine 500 μL FITC-dekstran çözeltisi (1 mg / mL) ve alt bölmeye 1.5 mL ortam (+/- ilgilenilen sitokin) ekleyin ve plakayı inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>İlgili zaman noktalarında alt bölmeden 120 μL ortam toplayın (örn. 0 dk, 15 dk, 30 dk, 60 dk, 90 dk, 120 dk, 150 dk ve 180 dk).</li>
	<li>Pipet, her zaman noktasının kopyalarını (50 μL/oyuk) siyah 96 oyuklu şeffaf düz tabanlı bir plakaya dönüştürür.</li>
	<li>FITC-dekstran'ı 490 nm'de uyarın ve bir plaka okuyucu kullanarak emisyonu 520 nm dalga boyunda okuyun.</li>
	<li>Standarda göre makromoleküler akı miktarını hesaplayın.</li>
</ol>

Human Esophageal Organoids and Air-Liquid Interface Culture Protocols

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Sağlanan prosedürler, başarı olasılığı yüksek olan hasta kaynaklı organoidlerin ve ALI kültürlerinin yetiştirilmesine izin verir. Organoid protokolü, insan özofagus organoidlerinin26 oluşumunu bildiren ilk yayınlanan protokolden ve yakın zamanda yayınlanan bir protokolden32 uyarlanmıştır. Sherill ve meslektaşları ALI model22'yi tanımladılar. Organoidler ve ALI kültür modelleri, EoE 5,26<s...

Özofagus iltihabı, özofagusun Th2 baskın kronik inflamatuar bir hastalığı olan eozinofilik özofajitte (EoE) gözlendiği gibi epitel bariyer bütünlüğünü 1,2,3,4,5 tehlikeye atar 6. EoE ilk olarak 1990'larda 7,8 tanımlanmıştır ve ağırlıklı olarak gıda antijenleri 9,10,11,12,13 tarafından indüklenmiştir. Yetişkin popülasyonda en sık görülen EoE semptomları disfaji ve gıda etkisidir14. Çocuklarda, EoE tipik olarak gelişememe, gıda reddi, kusma ve karın ağrısı ile kendini gösterir15. Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS), epitel bariyer bütünlüğünde yer alan EoE risk genlerini tanımlamış ve epiteli EoE araştırmasının odak noktasına taşımıştır 16,17,18. EoE transkriptomikleri ayrıca, bozulmuş bir farklılaşma sürecinin ve reaktif bir bazal bölge hiperplazisinin, özofagus epitelinin 3,5,19,20,21,22 bozulmuş bariyer fonksiyonuna neden olduğunu ortaya koydu. EoE'nin Th2 aracılı bir hastalık6 olduğunun erken anlaşılması, epitel bütünlüğünü bozarak IL-13'ün itici bir aracı olarak keşfedilmesine yol açmıştır 3,4,21,23. Epitel bütünlüğü üzerindeki sitokin aracılı etkilerin genetik yatkınlık yoluyla içsel bariyer bozukluğundan diseksiyonuna izin veren deneysel sistemler, EoE'deki immün hücreler ve epitel arasındaki karmaşık etkileşimi inceleme imkanı sağlar. İnsan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri, sitokin stimülasyonunun epitel bütünlüğü üzerindeki sonucunu analiz etmek için değerli araçlar olarak önerilmiştir5.
Yetişkin dokuya özgü kök hücre (ASC) türevi özofagus organoidlerinin üretilmesi için ilk protokol, 2009 yılında bağırsak organoidlerinin ilk yayınlanan raporlarından beş yıl sonra, ince bağırsağın epitel bölmesini özetleyen bağırsak Lgr5 + ASC'leri kullanılarak oluşturulmuştur24. DeWard ve ark. murin özofagus epitel hücrelerinden organoidlerin üretilmesine öncülük etti25. 2018'de Kasagi ve ark. ölümsüzleştirilmiş insan özofagus skuamöz epitel hücre hattı EPC2-hTERT ve birincil hasta kaynaklı hücrelerden insan özofagus organoidleri üretti26. Aynı yıl, Zhang ve ark. indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi özofagus organoidlerini başarıyla üretti. Özofagus progenitör hücre (EPC) gelişimi için TGFβ ve kemik morfogenetik protein (BMP) inhibisyonunun önemini ve tabakalı skuamöz epitelin farklılaşmasında Notch sinyallemesinin kritik rolünü tanımladılar26,27. Trisno ve meslektaşları, Sox2'yi gelişimsel kaderi özofagus farklılaşmasına yönlendiren bir Wnt inhibitörü olarak tanımlayarak bu bulguları tamamladılar28. Protokollerin, ortam bileşiminin ve kültür koşullarının müteakip iyileştirmeleri, organoid oluşum oranını arttırdı ve kriyoprezervasyondan sonra organoidlerin alt kültürlenmesini ve geri kazanılmasını mümkün kıldı 26,29,30,31,32. Bu organoidler, sitokinlerle stimülasyondan sonra doku mimarisini ve potansiyel hedef genlerin ekspresyonunu incelemek için güçlü araçlar olmasına rağmen, özofagus organoidleri, bariyer bütünlüğü için doğrudan ölçümler olarak transepitelyal direnci (TEER) veya makromolekül akısını ölçme imkanı sunmayacaktır. Sherrill ve meslektaşları22 tarafından daha önce tanımlandığı gibi, epitelyal farklılaşmayımodelleyen ALI kültürleri 4, epitel bütünlüğünün doğrudan değerlendirilmesine izin verir. Hasta kaynaklı organoidleri ve ALI kültürlerini birleştirmek, EoE'de doku mimarisini ve epitel bariyer bütünlüğünü araştırmak için güçlü bir araçtır.
Burada, özofagus biyopsilerinden canlı hücrelerin izole edilmesi ve sitokinlerin bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini incelemek için daha fazla kullanılabilecek özofagus organoid ve ALI kültürlerinin oluşturulması için talimatlar içeren prosedürler verilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis

Özofagusun skuamöz epiteli doğrudan çevreye maruz kalır ve sürekli olarak gıda antijenleri ve mikroplar dahil olmak üzere yabancı antijenlerle karşı karşıya kalır. Epitel bariyerinin bütünlüğünün korunması, enfeksiyonları önlemek ve zararsız gıda kaynaklı antijenlerin neden olduğu iltihaplanmayı önlemek için kritik öneme sahiptir. Bu makale, doku homeostazı ve hastalığı bağlamında özofagusun epitel kompartmanını incelemek için hasta biyopsilerinden insan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürleri oluşturmak için basitleştirilmiş protokoller sunmaktadır. Bu protokoller, son on yılda, hastadan türetilen birincil hücrelerden, organoidlerden ve hava-sıvı arayüz kültürlerinden üç boyutlu organ benzeri yapıları tanımlayan önemli bilimsel kilometre taşları olmuştur. Donörün fenotipik ve genetik özelliklerini korurken, özofagus epitelinde spesifik sitokinlerin, büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının işlevini üç boyutlu bir çerçeve içinde araştırma imkanı sunarlar. Organoidler, sitokin stimülasyonu sonrası transkriptom ve proteomu değerlendirerek doku mikromimarisi hakkında bilgi sağlar. Buna karşılık, hava-sıvı arayüz kültürleri, transepitelyal direnç (TEER) veya makromolekül akı ölçümleri yoluyla epitel bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesine izin verir. Bu organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürlerini birleştirmek, bozulmuş özofagus epitel bariyeri koşullarında araştırmaları ilerletmek için güçlü bir araçtır.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri 

Özofagus organoidleri, ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu ile belgelendiği gibi, sağlanan protokolün talimatlarına göre hasta biyopsilerinden ekstrakte edilen birincil hücrelerden büyüyecektir (Şekil 1). Epitelyal ASC'ler, izole edilen hücreleri bazal membran ekstraktında tohumladıktan sonra kültürün ilk iki günü içinde kendi kendini organize eden bir şekilde hücre kümeleri oluşturmaya başlar ve bir iskele görevi görür. Ters çevrilmiş parlak alan mikrosk...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Burada, insan özofagus organoidlerinin kültürü ve hava-sıvı arayüz kültürü için bir protokol sağlanmıştır. Özofagus organoidlerinin hava-sıvı arayüz kültürü, sitokinlerin özofagus epitel bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Eozinofilik özofajitin patofizyolojisini araştırıyoruz ve EOE'nin kronik inflamatuar sürecini indükleyen ve teşvik eden inflamatuar kaskadı çözmeye çalışıyoruz. Hastalık patogenezine katkıda bulunan yeni immün mediyatörlerin tanımlanması, epitel bariyerinin bozulması ve söz konusu immün mediyatörlere karşı terapötik antikorların onaylanması etrafında odaklanmıştır. IL-20 alt ailesi sitokinlerini, epitel farklılaşmasını ve keratinizasyonu bozan ve MAP kinaz yolağı yoluyla epitel bariyer bozukluğuna neden olan inflamatuar mediatörler olarak tanımladık.

three-dimensional-cell-culture-models-to-investigate-epithelial

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

Unit 1

Digestive System

SCIENTISTS IN ACTION

461 Görüntüleme.  University of Basel. Eozinofilik özofajitin patofizyolojisini araştırıyoruz ve EOE'nin kronik inflamatuar sürecini indükleyen ve teşvik eden inflamatuar kaskadı çözmeye çalışıyoruz. Hastalık patogenezine katkıda bulunan yeni immün mediyatörlerin tanımlanması, epitel bariyerinin bozulması ve söz konusu immün mediyatörlere karşı terapötik antikorların onaylanması etrafında odaklanmıştır. IL-20 alt ailesi sitokinlerini, epitel farklılaşmasını ve keratinizasyonu bozan ve MAP kinaz...

Video: Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.