Wir danken Rayhan Arif und Hassaan Shahawy für Kameraführung, Tripti Gupta und Frederike Alwes für Unterstützung Verfeinerung der Zell Ablation Technik und Labor Extavour Mitglieder für Rückmeldungen über die Daten-, Video-und Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise von der Harvard Stem Cell Institute unterstützt (Seed Förderkennzeichen SG-0057-10-00) die Ellison Medical Foundation (New Scholar Awards Nummer AG-NS-07010-10) mit CGE und Harvard College Research Program Auszeichnungen an ARN.

Kommentare, die hilfreich bei der Ausführung bestimmter Schritte sein können, sind in Kursivschrift angegeben. 1. Tag 1: Herstellung von Materialien <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Materialien (siehe Tabelle der Materialien und Geräte): <ul><li> 15 cm und 22 cm Pasteur Pipetten </li><li> Diamant-Schreiber </li><li> gefiltert künstlichem Meerwasser (Salzgehalt zwischen 0,0018 bis 0,0020), die 1 mg / ml Amphotericin B (1:100 einer 100 mg / ml Stammlösung), 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin (1:50 einer Stammlösung enthaltend 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 mg / ml Streptomycin) </li><li> gefiltert künstlichem Meerwasser (Salzgehalt zwischen 0,0018 bis 0,0020) ohne Zusatzstoffe </li><li> eine große Kunststoffbehälter zur Aufnahme Paare (mindestens 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> klein (3 cm oder 5 cm) Petrischalen mit Sylgard gesäumten </li><li> klein (3 cm oder 5 cm) Petrischalen </li><li> ein Uhrglas oder Glas Multi-Well-Platte </li><li> Pinzette (wir verwenden stumpfen Pinzette abgeleitet herm alt Dumont Nr. 5 Zange, die versehentlich in anderen Laborverfahren, die wir unter Verwendung einer Pinzette Schleifstein, um sicherzustellen, daß die Enden der Zange sind glatt, dass beide Zinken haben die gleiche Länge, und daß sie nicht mehr umfunktioniert beschädigt scharfen Spitzen. Extrem feine Pinzetten, wie neue Dumont Nr. 5 Zangen, sind unerwünscht, da diese Embryonen und / oder Frauen zu verletzen.) </li><li> eine Pasteur-Pipette mit dem Ende verbreitert (siehe Schritt 1.2 unten) </li><li> ein Embryo Retrieval-Tool, bestehend aus einer dünnen, gebogenen Wolframdraht in das dünne Ende einer Pasteur-Pipette eingebettet (könnte durch eine Alternative ersetzt implementieren werden, siehe 1.3 unten) </li><li> ein Mund Pipette mit einer kleinen Öffnung (siehe Schritt 1.4 unten) </li><li> ein Glas Nadel aus einer gezogenen Glaskapillare (siehe Schritt 1.5 unten) </li></ul> Keine Materialien für den Menschen giftig sind in diesem Protokoll verwendet. Allerdings sollten die Forscher sicherstellen, dass sie Handschuhe oder andere Schutzkleidung zu tragen, da durch das Risikomanagement erforderlich guidelines ihrer Institution. </li><li> Um die erweiterten Pasteur-Pipette, um einen ersten Punktzahl 15 cm Pasteur-Pipette an der Stelle, wo die Pipette beginnt mit einer Diamant-Schreiber einzugrenzen, wickeln Sie das erzielte Region der Pipette in einer Kimwipe oder Papiertuch, um die Finger zu schützen, und dann sorgfältig machen brechen Sie die Spitze an der Markierungslinie. Halten Sie die gebrochen Ende der Pipette über einem Bunsenbrenner-Flamme für einige Sekunden, um die Kanten zu glätten. Die Öffnung ist etwas schmaler als die maximale Breite der Pipette sein. </li><li> Um die Wolframdraht Dissektionswerkzeug machen, legen Sie eine Wolframdraht in das Ende eines 15-cm-Glaspasteurpipette und kurz halten, über der Flamme eines Bunsenbrenners, um das Glas zu schmelzen, Befestigungs den Draht. Verwenden einer Pinzette vorsichtig Kurve das Ende des Drahtes in eine Hakenform. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für eine geeignete Form für dieses Werkzeug. </li><li> Um eine kleine Öffnung für den Mund Pipette zu machen, ziehen Sie das dünne Ende einer 22 cm Pasteur-Pipette in zwei Teile over eine Flamme, und brechen Sie die Spitze des kleinen Endes. Legen Sie in das Ende des Mundpipettenhalter. </li><li> Machen Sie das Glas Nadel, die verwendet werden, um die Blastomeren der Zinsen während der Ablation mit einer Nadel durchstechen Abzieher wird. A geeignet geformten Nadel ist in Abbildung 4 dargestellt. Diese Nadel wurde auf einem Sutter P97 Nadelzieher mit einem Programm mit Parametern 2x gezogen (Wärme = 566, ziehen = 100, Geschwindigkeit = 20, Zeit = 250) + 1X (Wärme = 566, ziehen = 100, Geschwindigkeit = 100, Zeit = 250). Das spezifische Programm und Instrument benutzt, um die Nadel machen kann variieren, aber die Nadel eine feine Spitze haben, aber auch stabil genug, um nicht zu brechen, wenn sie gegen das Chorion des Embryos geschoben werden. </li></ol> 2. Tag 1: Sammeln Parhyale Gegen Paare <ol><li> Verwenden Sie die erweiterten Pasteur-Pipette (Schritt 1.2) zu sammeln Paarung P. hawaiensis Paare von der großen Kultur-Container, und übertragen Sie sie auf einem separaten Behälter, clehnen künstliche Meerwasser. Es ist nicht notwendig, dass diese Meerwasser gefiltert werden. Es ist am besten passenden Paare in den späteren Nachmittag zu sammeln und lassen Sie die Paare bei Raumtemperatur (20-23 ° C) über Nacht, so dass am nächsten Morgen, die meisten Embryonen vor kurzem befruchtet haben und abgeschieden wird, und somit am frühen Teilungsstadien geeignet für Ablation. Sammeln Sie mindestens 20 Gegenpaare, um sicherzustellen, dass einige Weibchen frühen Embryonen im Teilungsstadium tragen bis zum nächsten Morgen. </li></ol> 3. Tag 2: Sammeln Parhyale Embryonen <ul><li> Am nächsten Morgen ziehen gefiltert künstlichem Meerwasser (FASW) mit CO 2. Einige der Frauen werden von ihren Männern in der Nacht frei geschwommen haben, sammeln diese getrennt Weibchen und betäuben sie in FASW / CO 2. Die verbleibenden ungepaarten Männchen aus der Paarung Paar Behälter entfernt werden und zu dem großen Kultur. Verbleibende Gegenpaare können für Embryo-Entnahme später gespeichert werdenam Tag oder am nächsten Tag. </li><li> Übertragen einer einzigen weiblichen narkotisierten Durchführung Embryonen zu einem Uhrglas in FASW / CO 2. Alle Weibchen getrennt werden wahrscheinlich haben Eier gelegt, die sichtbar mit dem Auge so blass rosa oder lila Kügelchen durch die transparenten Platten coxal der Weibchen (Abbildung 1A) sein wird. Um festzustellen, ob die Embryonen in frühen Teilungsstadien und damit für Blastomere Ablation erforderlich, wird die Forscher haben, um die Embryonen aus der Bruttasche zu entfernen und untersuchen sie unter dem Mikroskop. </li><li> Anzeigen des Verfahrens unter einem Binokular, erfassen die coxal Platten entlang einer Seite des Körpers mit einer Pinzette. Die Embryonen werden in der ventralen Bruttasche zwischen diesen coxal Platten (1B) sichtbar sein. </li><li> Legen Sie die dünnen, gebogenen Drahtwerkzeug (3; Schritt 1.3) in das hintere Ende der Bruttasche, und heben Sie den Draht zum vorderen Ende der Bruttasche, um die Brut zu trennenBeutel Beläge (diese modifizierten ventralen Anhänge oostegites 30 genannt), das Öffnen der Tasche und Lösen der Embryonen. Die Embryonen, die in der ersten Stunde oder so von der Verlegung sind alle in einem sehr dünnen, transparenten Membran, die leicht durch den Drahtwerkzeug gestört werden wird eingeschlossen sind, verschwindet diese Membran um etwa 2-3 Stunden nach der Eiablage, und Embryonen sind nicht gebunden einander oder mit dem weiblichen in irgendeiner Weise von diesem Punkt an während der Embryogenese. Wenn Forscher finden es unbequem oder schwierig, die gebogenen Drahtwerkzeug manövrieren Embryonen aus der Bruttasche zu entfernen, eine alternative Implementierung verwendet werden, solange die Bewegungen sind sanft und keine harten Druck auf die Embryonen oder der Bruttasche angewendet. Andere Tools zum Entfernen von Embryonen aus der Bruttasche geeignet sind, schließen abgestumpft Zange oder ein Glas-Kapillare mit einem verschlossenen Ende und geglättet. </li><li> Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur-Pipette, um Wasser durch das geöffnete Bruttasche zu leeren, Ausschieben ter Embryonen, die an der Unterseite des Uhrenglases absetzen sollte. Übertragen Sie die weiblichen zu reinigen FASW (ohne CO 2), um die Wiedereinführung Erholung, bevor sie in die Hauptkultur zu ermöglichen. Mehrere Weibchen können in die gleiche Erholung Schale gelegt werden, aber erlauben Frauen voll, bevor sie dann wieder in die Hauptkultur zu erholen, als sie von anderen Tieren gefressen, wenn sie teilweise noch betäubt werden. </li><li> Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur-Pipette, um die Embryonen in eine Petrischale mit sauberem FASW übertragen, und zeigen unter dem Mikroskop auf ihre embryonalen Stadium zu bestimmen. Separate Embryonen, die am dritten Spaltung (Stufe 4 5), die für dieses Verfahren geeignet sind. Es sollte auch möglich sein, dieses Protokoll zu jeder Spaltung Stufe vor Keimscheibe Bildung gelten (Stufen 7-8 Mai). </li></ul> 4. Tag 2: Abtragen Einzelzellen <ol><li> Füllen Sylgard gesäumten Petrischale mit einer flachen Schicht FASW. Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur piPette einen einzigen Embryo auf die Platte übertragen. </li><li> Mit stumpfen Pinzette vorsichtig rollen den Embryo in die Zelle, die abgetragen werden (2A und 2B) zu identifizieren. Die Keimbahn g Vorstufe kann als der kleinste micromere, die auf der Oberseite des kleinsten macromere Mav sitzt identifiziert werden. Darüber hinaus wird g nicht direkt an den Zell en, die die von micromere es ist direkt gegenüber, wie die Mesoderm-Vorläufer Mikromeren ml und mr Aktie eine Zelle Grenze in der Mitte des Embryos. Mr ist die Blastomere nach rechts von g, und ml ist die micromere links g. Die Schwester Makromeren der herr, ml, und en sind die Vorläufer Ektoderm Er, El und Ep sind. </li><li> Mit einer Pinzette in der left Seits, wenn sich der Forscher Rechtshänder (oder der rechten Hand, wenn der Forscher Linkshänder), Ausrichten der Embryo mit der interessierenden Zelle nach rechts (oder nach links, wenn sich der Forscher Linkshänder), und leicht zu begreifen, den Embryo zwischen der Zange, um es zu stabilisieren. </li><li> Mit einem Glas Nadel gezogen (Schritt 1.5 oben, Abbildung 4), sanft Punktion der Zelle von Interesse. Sie die Nadel nicht zu weit stecken, damit sie nicht, um die Nadel in die Zellen oder unterhalb der benachbarten Zelle von Interesse zu schieben. Die Nadel muss nur die Chorion und darunterliegenden Zellmembran durchstechen, und muss nicht tief in die Zelle abzutragenden erstrecken. </li><li> Tauschen Sie die Nadel verwendet werden, um den Embryo für die Glas Ende einer Pipette Mund mit einer feinen Punktion gezogen Pasteur-Pipettenspitze (Schritt 1.4). Halten Sie die Spitze der Pipette in der Nähe des Loch in der Zelle von Interesse erstellt und gelten sehr sanfte Saugwirkung. </li><li> Sehr sanft drücken den Embryo mit der Zange. Da der Inhalt des blastonur aus dem Chorion durch das Loch im Schritt 4.4 erstellt geschoben, saugen sie in den Mund Pipette auf einen freien Blick auf den Embryo zu ermöglichen. Wenn das Loch groß genug ist, kann der Kern des punktierten Zelle gesehen werden, als auch auftauchen. Dies ist eine gute Kontrolle sicherstellen, dass die gesamte Zelle Inhalte wurden entfernt und können nicht regeneriert werden. </li><li> Beachten Sie sorgfältig den Embryo als die Blastomere von Interesse wird entfernt. Der Rand der Zelle durchstochen wird auf das Loch in dem Chorion zurücktreten, so dass die Schnittpunkte der darunterliegenden Zellen sichtbar. Anwenden von Druck weiter, bis alle Blastomere von Interesse wurde entfernt. Verwenden einer Pinzette, um den Embryo von Seite zu Seite und rollen visuell zu bestätigen, dass alle von der Blastomere von Interesse ist weg. </li><li> Mit einer unveränderten 15 cm Pasteur Pipette den Embryo zu reinigen FASW + (FASW + 1 mg / ml Amphotericin B, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin). </li><li> Raise-Blastomere abgetragen Embryonen in einzelnen Wellseiner sauberen 48-Lochplatte in FASW +, 50% Veränderung der Antibiotika ergänztem FASW + täglich. In unseren Händen Embryonen überleben und gut zu entwickeln, auch nach Ablation, in einem Temperaturbereich von 18 bis 28 º C. Forscher sollten ihre Embryonen bei einer Temperatur, für die sie eine saubere (aber nicht unbedingt steril) Oberfläche, auf der die Embryonen mit minimaler Störung erhöhen haben zu erhöhen. Um den Zeitpunkt der Entwicklungs Ereignisse in Blastomere-abgetragen Embryonen mit Kontrollen vergleichen zu können, verweisen wir auf die ausführliche Entwicklungs Inszenierung Informationen, die für Embryonen bei 18 º C 4, 25 º C 4 angehoben verfügbar ist, und 26 º C 5,6. </li></ol>

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben ein Protokoll für Hand Ablation und vollständige physische Entfernung der einzelnen Blastomeren vom frühen Teilungsstadien des Floh P. hawaiensis. Wir zeigen Verwendung dieses Protokolls durch Entfernen der einzelnen Keimbahn-Vorläuferzelle g aus einem Acht-Zell-Stadium Embryo, und zeigen, dass die Ablation wurde durch die Bestätigung Abwesenheit von g &#39;s Tochter-Zellen in der Embryogenese später erfolgreich. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ...

Der Flohkrebstier Parhyale hawaiensis hat sich in den letzten zehn Jahren als vielversprechende Modellorganismus mit großem Potenzial für den Einsatz in der evolutionären Entwicklungsbiologie Forschungs 1 entstanden. Unter den Arthropoden, die meisten Modellsysteme sind Insekten, und die meisten von ihnen ausgiebig studiert ist die Taufliege Drosophila melanogaster. D. melanogaster ist ein Mitglied der Insektenordnung Diptera, und als solche zeigt viele embryologische Funktionen, die mit Bezug auf diejenigen der basal Verzweigungs 2 Insekten abgeleitet sind. Darüber hinaus werden Insekten in der Unterabteilung Pancrustacea 3 verschachtelt, was bedeutet, dass Insekten haben ihre nächsten Verwandten in der langjährigen &quot;natürliche&quot; Gruppe namens pancrustaceans, und dass diese Gruppe paraphyletic. Dies deutet darauf hin, dass zusätzlich zu basal abzweigInsekten Modelle werden Studien von anderen Krebstieren erforderlich, um eine umfassendere Sicht der Evolutionsgeschichte der Entwicklungsmerkmale gewinnen einnd molekularen Mechanismen, die so gut in D. untersucht worden sind melanogaster. Aber nur sehr wenige Krebstiere sind gut für experimentelle Laboranalyse der Entwicklung etabliert. Der Floh P. hawaiensis ist ein sehr gefügig Labor Modellsystem zugänglich zu einer Reihe von experimentellen Techniken. Amphipoden zeigen viele einzigartige Features in ihre Mutter Peracarida Überordnung (Strand Trichter, Scud-Raketen, und auch Garnelen) und werden daher vermutlich relativ innerhalb dieser Gruppe von Krebstieren abgeleitet werden. Dennoch ist die relative Leichtigkeit der embryologischen und funktionellen genetischen Manipulation von Parhyale angeboten machen dieses Floh eine wertvolle Ergänzung zu den aktuellen Bestand von Modellorganismen. Als Labortier, P. hawaiensis bietet viele Vorteile. Tiere sind tolerant zu einem breiten Spektrum von Temperaturen und Salzgehalte und gut überleben in großen Kulturen von künstlichem Meerwasser ein. Es ist leicht zu unterscheiden zw.een Männer und Frauen, die auf klaren morphologischen Unterschiede, vor allem, die großen, gehakt, Vorderrumpf Anhänge, die zu verwenden, um die Weibchen während der Paarung zu erfassen Männchen. Für embryologische und Entwicklungsarbeit, P. hawaiensis hat mehrere sehr ansprechende Features. Embryogenese dauert etwa 10 Tage und die Zeit bis zur Geschlechtsreife ist etwa sechs Wochen bei 28 º C (aber beachten Sie, dass Parhyale überlebt auch bei Temperaturen von ca. 20-30 ° C, und eine ausführliche Entwicklungs Inszenierung Informationen für Embryonen bei 18 º C 4 angehoben verfügbar , 25 ° C 4 und 26 º C 5,6). Erwachsene passen das ganze Jahr über im Labor, so dass Embryonen sind zu jeder Zeit des Jahres zur Verfügung. Die Weibchen legen 2-20 (je nach dem Alter der Frau) befruchteten Eier in eine Bruttasche ventralen zwischen der ersten mehrere Paar Beine (1A und 1B) gelegen, und es ist möglich, diese zu sammeln Embryos sehr früh in der Entwicklung, ohne die weibliche Töten oder Beschädigung der Embryonen (Abbildung 1C). Die Embryonen überleben in künstlichem Meerwasser gefiltert bis zum Schlüpfen können für nachfolgende Genexpression oder histologische Analyse 7 festgelegt werden, und eine detaillierte Testtabelle ermöglicht eine genaue Identifikation der Fortschritt durch Entwicklung 5. Robust Protokolle wurden zur Genexpressionsanalyse durch in situ Hybridisierung 8-15 oder Immunfärbung 4,16,17 durchzuführen, funktionelle Knockdown durch RNA-Interferenz oder 13,15 morpholinos 12, und stabile Keimbahntransgenese 18. Verwendung der Transgenese System induzierbaren Expressionsverstärker 14 und 19 abzufangen Methoden können auch verwendet werden, um die Genfunktion in P. untersuchen hawaiensis. Während ein öffentlich verfügbaren Genomsequenz ist derzeit nicht verfügbar ist, enthält eine Transkriptom-Transkripte während der Oogenese und Embryogenese hergestellte Bienenn de novo und kommentierte 20 und in einer durchsuchbaren Datenbank hinterlegt 21, die Erleichterung Gen Entdeckung. Insgesamt P. hawaiensis ist ein sehr gefügig Modellorganismus geeignet für mehrere experimentelle und genetische Ansätze zum Verständnis der Entwicklung. Im Gegensatz zu den frühen Syncytial-Spaltungen von D. melanogaster, P. hawaiensis Embryonen spalten holoblastically nach der Befruchtung (Abbildung 2A). Lineage Tracing Analyse hat gezeigt, dass durch die dritte Schnittstelle, wobei jede der dritten Spaltungs Blastomeren ist speziell dazu bestimmt, um die zu einem der drei Keimblätter oder die Keimbahn 6 (Fig. 2B) erhalten wurde. Diese Daten, zusammen mit Microarray-Daten 22, Zelllinie analysiert 6,23 und 4 Blastomere Isolationsexperimente haben vorgeschlagen, dass Entwicklungspotentiale sind getrennt, zumindest einigen Dritt Spaltung Blastomeren durch asymmetrische Vererbung von cell Schicksal Determinanten. Dementsprechend wird in Blastomere Ablation Experimenten, bei denen die Keimbahn-Vorstufe (im Parhyale Zelllinie 6 Nomenklatur als &quot;g&quot;) wurde bei der acht Zellen-Stadium entfernt fehlte Embryonen Keimzellen in späteren Entwicklungsstadien 4, wie durch die Abwesenheit von Zellen angegeben Expression des Proteins Vasa, die eine Keimbahnmarkierung in den meisten Metazoen 24 ist. Im Gegensatz dazu zeigten die somatische Blastomere Ablation Experimente, dass P. hawaiensis Embryonen besitzen auch erhebliche regulatorische Fähigkeiten, so dass die Schicksale der Mesoderm oder Ektoderm Vorläufer Blastomeren im Acht-Zell-Stadium abgetragen kann über von den Nachkommen der einige der verbleibenden 25 Blastomeren entnommen werden. Wie regulative Zellschicksal Austausch stattfinden kann, und das Ausmaß der autonomen Zellschicksal Annahme durch somatischen Blastomeren, bleibt unbekannt. Experimentelle embryologische Techniken wie Blastomere Ablation in under nützlich seinding die relative Autonomie und Unselbständigkeit des Zellschicksals 26,27 Entscheidungen und sind daher von Interesse, die in der Studie von P. hawaiensis Embryogenese. In den Experimenten, die regulative Ersatz von ektodermalen und mesodermalen Linien gezeigt wurde Blastomere Ablation durch Injektion 28 und nachfolgende Anregung der Farbstoffe phototoxische 25 durchgeführt. Während diese Technik effektiv bei der Abtötung der eingespritzten Blastomere (n) ist, ist es nicht völlig den toten Zellkörper aus dem Embryo zu entfernen. Außerdem wurden Unterschiede zwischen Zelllinie Daten bis zur Gastrulation Stufen der Embryogenese durch Injizieren Blastomeren mit fluoreszierenden Tracer Linie 28,29 gesammelt, und Daten, die durch folgende ungestörten Blastomeren durch Entwicklung derselben Embryonalstadien 23 gesammelt beobachtet. Vollständige physische Entfernung spezifischer Blastomeren kann daher ein bevorzugtes Verfahren zur Ablation für einige Anwendungen. Wir haben vorher veröffentlicht die Ergebnisse der Zelllinie Analysen von Embryonen, in denen einzelne Zellen wurden manuell abgetragen 23. Doch die zarten Operationen erforderlich, um einzelne Blastomeren vom frühen Embryonen im Teilungsstadium zu entfernen noch nicht vollständig beschrieben. Hier ein Protokoll für die Sammlung von P. präsentieren wir hawaiensis Embryonen und manuelle Ablation eines einzelnen Blastomeren aus einem Acht-Zell-Stadium Embryo. Das Ziel dieser Methode ist, um die vollständige Entfernung des Zellkörpers aus dem Embryo zu erreichen, so dass die Beobachtung der Zellverhalten und Zellschicksal Kompetenzen von den übrigen Zellen in der Embryogenese und post Embryonalentwicklung. Unser Protokoll zeigt die Entfernung von der Keimbahn-Vorläufer g (2C), aber kann auf jede beliebige Zelle in der Acht-Zellen-Stadium aufgebracht werden, oder Blastomeren früheren Teilungsstadien. Im Prinzip könnte dieses Protokoll angewandt, um einzelne Zellen aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von othe entfernenr holoblastically Spaltung wirbellose Meerestiere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

Der Floh Parhyale hawaiensis ist ein kleines Krustentier in Gezeiten marine Lebensräume weltweit gefunden. In den vergangenen zehn Jahren hat sich Parhyale als eine vielversprechende Modellorganismus für Laboruntersuchungen von Entwicklung entstanden, ein nützliches Fremdgruppe Vergleich zur bekannten Gliederfüßer Modellorganismus Drosophila melanogaster. Im Gegensatz zu den Syncytial-Spaltungen von Drosophila, sind die frühen Spaltungen von Parhyale holoblastisch. Fate Mapping mit Tracer-Farbstoffe in frühen Blastomeren injiziert haben gezeigt, dass alle drei Keimblätter und der Keimbahn werden von der Acht-Zell-Stadium etabliert. Zu diesem Zeitpunkt werden drei Blastomeren beschieden, die zu dem Ektoderm geben, drei sind dazu bestimmt, um die zu dem Mesoderm zu geben, und die verbleibenden zwei Blastomeren sind die Vorstufen von Endoderm und Keimbahn sind. Allerdings haben Blastomere Ablation Experimente gezeigt, dass Embryonen Parhyale signifikanten regulatorischen capabiliti besitzen auches ist, so dass die Schicksale der Blastomeren im Acht-Zell-Stadium abgetragen kann über von den Nachkommen der einige der verbleibenden Blastomeren entnommen werden. Injektion und die anschließende Aktivierung von phototoxischen Farbstoffe oder manuelle Abtragen: Blastomere Ablation wurde zuvor von einem von zwei Verfahren beschrieben worden. , Tötet jedoch photoablation Blastomeren jedoch nicht die toten Zellkörper aus dem Embryo zu entfernen. Vollständige physische Entfernung spezifischer Blastomeren kann daher ein bevorzugtes Verfahren zur Ablation für einige Anwendungen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die manuelle Entfernung von einzelnen Blastomeren aus dem Acht-Zell-Stadium des Embryos Parhyale, veranschaulicht, die Instrumente und manuellen Verfahren, die für die vollständige Entfernung der Zellkörper, während die übrigen Blastomeren lebendig und intakt. Das Protokoll kann auf jeden Parhyale Zelle im Achtzellstadium oder Blastomeren von anderen frühen Teilungsstadien angewendet werden. Darüber hinaus grundsätzlich Dieses Protokoll könnte für frühe Clea seinvage Embryonen anderer holoblastically Spaltung wirbellose Meerestiere.

Nach der erfolgreichen Ablation von Einzel dritte Spaltung P. hawaiensis Mikromeren wie in diesem Protokoll beschrieben, nach und nach die restlichen Mikromeren ihre Positionen leicht verschieben, um so den Raum früher von der abgetragenen Blastomere besetzt teilweise zu besetzen. Zum Beispiel, wenn g wird entfernt, der benachbarten Blastomeren mr ml und leicht verschoben und kommen, um die seitlichen Zellgrenzen, die früher in direktem Kontakt mit g (vgl. <s...

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Der Floh Parhyale hawaiensis ist eine vielversprechende Modellorganismus für die Untersuchung der Krustentier Embryologie und vergleichende Arthropoden Entwicklung und Evolution. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die manuelle Entfernung der einzelnen Blastomeren aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von Parhyale.

Ablation von einer einzigen Zelle ab Acht-Zell-Embryonen der Amphipod Schalentier<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.4K Aufrufe.  Harvard University.  Der Floh Parhyale hawaiensis ist eine vielversprechende Modellorganismus für die Untersuchung der Krustentier Embryologie und vergleichende Arthropoden Entwicklung und Evolution. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die manuelle Entfernung der einzelnen Blastomeren aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von Parhyale. 

Serie: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Forschung

Biologie

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Einzelzell-Suspensionspräparat aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...