Die Probenvorbereitung in der Kryotechnik steht vor Herausforderungen, die ihre Wirksamkeit einschränken können, insbesondere bei einer ungleichmäßigen Partikelverteilung. Dieses Problem führt oft zu einer schlechten Auflösung und verminderter Genauigkeit bei neu konstruierten Proteinstrukturen. Verschiedene experimentelle Ansätze werden verwendet, um eine ungleichmäßige Partikelverteilung zu überwinden, einschließlich der Zugabe von Detergenzien oder Membranimitatoren zur Probe, der Modifikation der Gitterstützfolie und dem Kippen eines bestimmten Tisches während der Datenerfassung.
Dieses Protokoll analysiert eine einfache, praktische Methode, um eine ungleichmäßige Partikelverteilung durch Optimierung der Probenvorbereitung zu beheben, und bietet Forschern eine Referenz zur effizienten Veranschaulichung von Makromolekülstrukturen mit Kryogen. Sammeln Sie zunächst die gepoolten Proteinfraktionen, die das kleine Hitzeschockprotein 16,5 MJ enthalten. Verwenden Sie Zentrifugalfilter mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 50 Kilodalton, um die Fraktionen bei vier Grad Celsius auf etwa 65 Milligramm zu konzentrieren.
Nach der Konzentration wird die Probe 10 Minuten lang bei 16.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um Aggregate zu entfernen. Aliquotieren Sie 50 Mikroliter Volumen des Überstands in 0,2 Milliliter dünnwandige PCR-Röhrchen. Für die Transmissionselektronenmikroskopie tauen Sie zwei gefrorene Proteinröhrchen auf Eis auf.
Nach dem Auftauen schnippen Sie die Röhre mehrmals, um sie zu mischen. Dann zentrifugieren Sie die Proteinlösung bei 16.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Aggregate zu entfernen. Als nächstes injizieren Sie den Überstand auf eine Größenausschlusschromatographiesäule und sammeln 0,5 Milliliter Elutionsfraktionen.
Sammeln Sie die elucianischen Fraktionen, die dem Peak entsprechen und bei 280 Nanometern die höchste ultraviolette Absorption aufweisen. Für den Puffertausch schneiden Sie mit einer Schere eine Dialysemembran in 30 mal 30 Millimeter große Stücke. Inkubieren Sie die Stücke in destilliertem Wasser oder Pufferlösungen, um sie auszugleichen.
Geben Sie anschließend 55 Mikroliter der Proteinlösung in eine Kammer mit 50 Mikrolitern Mikrodialyseknöpfen. Halten Sie die Dialysemembran mit einer Pinzette senkrecht und berühren Sie vorsichtig eine Kante der Membran mit Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit abzulassen. Decken Sie den Mikrodialyseknopf vorsichtig mit der Membran ab.
Legen Sie den O-Ring auf die Dialysemembran und rollen Sie ihn vorsichtig in die Rille am Rand des Knopfes. Tauchen Sie jeden Dialyseknopf mit der Membranseite nach oben in ein separates Becherglas mit dem Zielpuffer. Verwenden Sie eine Spritze mit einer feinen Nadel, um die Membran vorsichtig zu durchstechen und die Proteinlösung aus der Mikrodialysekammer zu gewinnen.
Laden Sie fünf Mikroliter der Probe in einer Konzentration von 20 bis 120 Nanogramm pro Milliliter auf ein Glimmentladungsgitter. Bereiten Sie drei Wassertropfen à 50 Mikroliter auf einem Paraffinfolienblatt vor. Reiben Sie die Gitteroberfläche gegen die Wassertropfen, um die Probe zu waschen.
Laden Sie nun fünf Mikroliter gefilterte 1%ige Urinalacetatlösung auf das Gitter und pipettieren Sie die Urinalacetatlösung sofort weg. Laden Sie weitere fünf Mikroliter der Urinalacetatlösung auf das Gitter. Berühren Sie vorsichtig die Pinzettenseite des Gitters mit Filterpapier, um überschüssige Fleckenlösung zu entfernen, und lassen Sie das Gitter trocknen.
Montieren Sie die Pinzette und die Glühentladungsgitterbaugruppe am Instrument. Laden Sie dann vier Mikroliter der Probe auf die Kohlenstoffseite des Gitters. Starten Sie den Tauchgefriervorgang.
Um die Gitter für das Laden auf das Transmissionselektronenmikroskop (TEM) vorzubereiten, platzieren Sie zunächst eine Gitterbox mit keramischen Gittern in der Auto-Grid-Montagestation und schrauben Sie den Deckel einer Gitterbox mit keramischen Gittern ab. Platzieren Sie den Auto-Grid-Ring in der dafür vorgesehenen Ausschnittstelle an der Montagestation. Ziehen Sie das verglaste Gitter vorsichtig aus dem Gitterkasten und setzen Sie es in den automatischen Gitterring ein.
Richten Sie nun die Scheibe so aus, dass die kreisförmige Öffnung auf dem Auto-Grid-Ring und der Gitterbaugruppe positioniert ist. Um das Gitter im Auto-Gitterring zu fixieren, platzieren Sie das Einführwerkzeug für den C-Clip auf dem Gitter und drücken Sie es leicht nach unten, um den C-Clip darin zu befestigen. Drehen Sie die Disc zurück und schieben Sie die zusammengebauten Gitter in die Aufbewahrungsbox mit automatischem Gitter.
Montieren Sie die Kassettenladestation und kühlen Sie sie mit flüssigem Stickstoff. Platzieren Sie die Auto-Grid-Aufbewahrungsbox in der Ladestation. Verschieben Sie die Gitterbaugruppe aus der Auto-Grid-Aufbewahrungsbox in die Kassette.
Verwenden Sie den Griff, um die Kassette in die Autoloader-Kapsel zu legen. Überprüfen Sie den Stift im Autoloader, um seine freie Bewegung zu bestätigen und sicherzustellen, dass er nicht eingefroren ist. Die Partikelakkumulation in Arrays wurde auf allen getesteten Gittern beobachtet, unabhängig von den Pufferbedingungen oder Oberflächenladungsmodifikationen.
Eine höhere Proteinkonzentration in Kombination mit negativ geladenen Gittern in neun Millimolar Mobstress, 50 Millimolar Natriumchlorid und 0,1 Millimolar EDTA-Puffer führte zu der gewünschten Verteilung einzelner Partikel in den Gitterlöchern, wodurch die Bildung von Proteinarrays reduziert wurde. Dieser optimierte Zustand führte zu einem hohen konischen FSC-Flächenverhältniswert von 0,80 und einem SCF-Wert von 0,859, was eine gleichmäßige Partikelverteilung bestätigt.
