Die Funktionen von Proteinen sind temperaturabhängig und bei der Temperatur optimal. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, Proteinstrukturen bei höheren Temperaturen zu lösen. Dieser Ansatz kann funktionell relevante Strukturen liefern und das Verständnis der Temperaturabhängigkeit von Proteinstrukturen verbessern.
Yuan-Chih Chang, Manager der Academia Sinica Cryo EM-Anlage, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit einem Loch von einem Zentimeter in einem 50-Millimeter-Zentrifugenröhrchen an seinem geschlossenen Ende. Legen Sie das Rohr in die Kammer der Verglasungsapparatur am Ultraschallwasserauslass.
Stellen Sie die Temperatur des Verglasungsgeräts auf die angegebene Temperatur ein und lassen Sie die Verglasungsgerätekammer 55 Grad Celsius und 100% relative Luftfeuchtigkeit erreichen. Lassen Sie es mindestens eine halbe Stunde stehen, um die Bedingungen zu stabilisieren, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Stellen Sie das Wasserbad auf eine Kochplatte und stellen Sie die Heizplatte auf die gewünschte Temperatur.
Überprüfen Sie mit einem Thermometer, ob das Wasser 55 Grad Celsius erreicht. Inkubieren Sie die Probe im Wasserbad und heizen Sie die Pipettenspitze am Rand der Heizplatte zwei Minuten oder länger vor dem Blotting-Experiment vor. Glow-Entladung eines löchrigen kohlenstoffgestützten Gitters bei 25 Milliampere für 30 Sekunden.
Legen Sie das Vitrifikationsfilterpapier frühestens fünf Minuten vor dem Blotting-Versuch in die Kammer des Vitrifikationsapparates. Inkubieren Sie die Pinzette mit dem Gitter im Vitrifikationsapparat für zwei Minuten oder länger. Bauen Sie den Ethanbehälter mit Ethan nach Standardverfahren, um sicherzustellen, dass das Ethan nicht überläuft.
Verwenden Sie eine Pipette, um sieben bis neun Mikroliter der Probe auf das Gitter aufzutragen. Warten Sie dann ein bis zwei Sekunden, tupfen Sie ein bis eineinhalb Sekunden ein und tauchen Sie die Probe schnell in flüssiges Ethan. Übertragen Sie das Gitter von flüssigem Ethan in die Kryobox, die in flüssigem Stickstoff gespeichert ist.
Clippen Sie die Gitter und entladen Sie sie, um das Elektronenmikroskop oder das Kryo-EM-Instrument zu erfassen. Verwenden Sie den Bildschirm des Cryo EM-Instruments und die Niedrigdosisfunktion der Software, um den Eiszustand auf dem Gitter und die Verteilung der Probe auf dem Gitter zu überprüfen. Wenn die Qualität des resultierenden Rasters nicht gut ist, wiederholen Sie den Prozess der Netzvorbereitung mit verschiedenen Bedingungen wie Wartezeit, Löschzeit usw.
Wenn die Qualität des resultierenden Gitters gut ist, wiederholen Sie die gleichen Schritte, um Gitter mit einer anderen Temperatur zu erstellen. Übertragen Sie die qualitativ hochwertigen Gitter auf ein hochauflösendes Cryo EM-Instrument. Führen Sie Datenerhebung und Datenanalysen nach festgelegten Verfahren durch.
Im Falle des erfolgreichen Gitters bildete sich ein Eisgradient mit dickerem Eis oben links im Gitter und dünnerem Eis unten rechts. Im erfolgreichen Raster wurden blaue und grüne Kästchen beobachtet, die für die Datenerfassung geeignet sind. Im anderen Raster wurde ein heller Kontrast beobachtet.
Dies zeigt eine dünne Eisschicht oder eine Abwesenheit von Eis an. Nur zwei Quadrate wurden für die Datenerfassung im zweiten Raster als geeignet befunden. Eines der Gitter bestand hauptsächlich aus Eis in Kristallform, was für die Datenerhebung ungeeignet war.
Auf der anderen Seite zeigte das andere Raster, dass sich die Eisschicht meist in einem amorphen Zustand befand, der für die Datenerhebung geeignet war. Die Vorbereitung des Behälters und anderer muss nach einem bestimmten Zeitpunkt abgeschlossen sein. Zeitkontrolle und das schnelle und genaue Beenden des Experiments sind am wichtigsten.
Abhängig von den Ergebnissen, die mit diesem Protokoll erzielt wurden, muss der Forscher möglicherweise bei der Einrichtung der einfachen Bedingungen vorsichtiger sein.
