El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

Resumen

La célula permeable reticulante DSP [ditiobis (propionato de succinimidilo)] estabiliza interacciones transitoria e inestable In vivo, Lo que permite su aislamiento con estrictas técnicas de purificación de proteínas complejas. Aquí se presenta una técnica para que las células en un cultivo de entrecruzamiento seguido por el aislamiento de complejos de proteínas por inmunoprecipitación.

Resumen

La naturaleza dinámica de los mecanismos celulares con frecuencia se basa en las asociaciones de proteínas transitoria y / o débiles. Estas interacciones de baja afinidad excluye métodos estrictos para el aislamiento e identificación de las redes de proteínas alrededor de una proteína de interés. El uso de productos químicos reticulantes permite la estabilización selectiva de las interacciones lábiles, evitando así las limitaciones de bioquímica para la purificación. Aquí se presenta un protocolo susceptible de células en cultivo que utiliza un agente de reticulación homobifuncionales con un brazo espaciador de 12 Å, ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP). DSP se separa por reducción de un puente disulfuro en la molécula. La reticulación en combinación con la cromatografía de inmunoafinidad de proteínas de interés con bolas magnéticas permite el aislamiento de complejos de proteínas que de otro modo no resistiría la purificación. Este protocolo es compatible con las técnicas regulares de Western blot y puede ser ampliado para la identificación de proteínas por espectrometría de masas ^1.

Stephanie A. Zlatic y Pearl V. Ryder contribuyeron igualmente a este trabajo.

Protocolo

1. Preparación para la reticulación

1. Será necesario que la placa de un número suficiente de células para permitir el aislamiento de 500 g de proteína por cada tubo de reacción estándar. Un único tubo puede ser suficiente para la identificación de los interactores putativo de una proteína de interés por inmunoblot. En este caso, material de cordón atado puede ser eluida con tampón de muestra SDS-PAGE (inmunoprecipitación). Para el análisis de espectrometría de masas, el número de reacciones estándar debe ser aumentado por lo menos diez veces y complejos de proteínas debe ser eluida por fuera de la competencia con un péptido antígeno reconocida por el anticuerpo utilizado (cromatografía de inmunoafinidad). Esta estrategia permitirá el aislamiento de los complejos de proteínas libres de inmunoglobulina.
2. La densidad óptima de la célula para la reticulación es entre 75% y el 90% de confluencia. En condiciones de alta confluencia, las células tienden a apilarse unos sobre otros, lo que disminuye la accesibilidad a la reticulante penetran en las células de todas las células.
3. Tipo de células y condiciones experimentales deben estar etiquetados en la parte inferior de la placa de la célula. En forma rutinaria se incluyen controles con el vehículo solo.
4. Prepare todas las soluciones, excepto la solución DSP antes de la reticulación.
   1. Prepare un inventario de tampón fosfato buffer salino con _CaCl2 0,1 mM y 1 mM _CaCl2 (PBS / Ca / Mg) antes de comenzar el experimento. La adición de iones calcio y magnesio es esencial para la adhesión de las células de la placa de cultivo durante el transcurso del experimento. Almacenar a 4 ° C.
   2. 50X de la proteasa completo cóctel de inhibidores de - 1 tableta disuelta en 1 ml de agua Milli-Q. Almacenar a -20 ° C.
   3. 20% de Triton X-100 Pesar 10g Triton X -100 y se diluye en el volumen total de 50 ml de agua Milli-Q. Rock en 4 ° C durante la noche y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. No almacenar por más de 1 mes. Use las diluciones de esta población un 20% para preparar los tampones de lisis y IP se describen a continuación.
   4. 50X DSP enfriamiento solución 1M Tris a pH 7,4. Conservar a temperatura ambiente.
   5. Preparar un buffer 10x una solución.
      Buffer 10X A:
      • 50 ml de 1 M HEPES
      • 150 ml de NaCl 5 M
      • 10 ml de 0,5 M EGTA
      • 250 l 2 M _de MgCl2
      • Ajustar el pH a 7.4
      • Alcanzar un volumen final de 500 ml
      El Buffer 10X Una solución se diluye a 1X tampón A cuando sea necesario.
      Buffer 1x A también se usa en el lisado y tampones inmuno-magnética-precipitación.
      Un tampón 1X
      • Hepes 10 mM
      • 150 mM NaCl
      • 1 mM EGTA
      • 0,1 mM de MgCl ₂
      • pH 7,4
   6. Tampón de lisis 1X tampón A + 0,5% Triton X-100.
   7. Inmuno-magnética tampón de (Buffer IP) 1X tampón A + 0,1% Triton X-100.

2. Preparación de la solución de reticulación

1. Prepare la solución DSP inmediatamente antes de aplicar a las células. DSP es altamente hidrofóbico y se disuelven en DMSO antes de diluir en PBS / Ca / Mg de amortiguamiento. Disolver 40 mg de DSP en 1 ml de DMSO. Esto hace que una solución 100 mM de DSP (El peso molecular del DSP es 404,42 g / mol).
2. Caliente un volumen adecuado de PBS / Ca / Mg a 37 ° C con el fin de facilitar la dilución de la DSP / DMSO en PBS.
   Volúmenes necesarios para una variedad de tamaños de placas:
   6-así placa de 2 ml por pozo
   10 cm placa de 10 ml por placa
   15 cm placa de 20 ml por placa
3. Añadir 10μL de solución madre DSP / DMSO por cada 1 ml de PBS caliente / Ca / Mg. Añadir DSP / DMSO gota a gota solución de reserva con la mezcla repite hasta que todos los DSP se ha disuelto. Prepare una solución de control de 10 l DMSO añadido a cada 1 ml de PBS / Ca / Mg.
4. Lugar todas las soluciones de PBS / Ca / Mg en un baño de agua helada no más de 10 min.

3. Preparar las células para la reticulación

1. Prepare un baño de agua helada que se ajuste a todas las placas para la reticulación o la incubación control del vehículo.
2. Tomar placas de la incubadora a 37 ° C y colocarlos inmediatamente en el baño de agua helada.
3. Lavar las células dos veces con helado de PBS / Ca / Mg. Usar el mismo volumen que va a utilizar para la incubación reticulante (ver sección 2.2).
4. Quitar segundo lavado y añadir ya sea el control del vehículo o la solución de DSP entrecruzamiento de amortiguamiento.
5. Incubar en hielo durante dos horas. Usted debe verificar las placas aproximadamente cada veinte minutos para asegurarse de que todas las células están cubiertos por la solución. Usted puede notar una pequeña cantidad de DSP se precipitan fuera de la solución. Esto es normal.

4. La inactivación de reacción DSP

1. Prepare una solución 1X DSP de enfriamiento de 20 mM Tris pH 7,4 en PBS / Ca / Mg (20 l de 1 M Tris pH 7,4 por cada 1 ml de PBS / Ca / Mg).
2. Quitar el control del vehículo y las soluciones de reticulación.
3. Añadir helada solución inactivación e incubar en hielo durante 15 minutos.

5. Lisis celular

1. Durante la incubación de enfriamiento DSP, preparar la solución amortiguadora de lisis celular de 0,5% Triton X-100 en tampón A con un cóctel completo inhibidor de la proteasa. Añadir 20 l solución de archivo de 50X completa para cada solución amortiguadora de lisis 1 mL.
2. Después de la incubación de 15 minutos de enfriamiento DSP, lavar las células dos veces con PBS / Ca / Mg.
3. Añadir tampón de lisis completa + a las células y el rock a 4 ° C durante 30 minutos. Algunos sugirieron que los volúmenes de tampón de lisis para una variedad de tamaños de placas:
   • 6-así placa de 0,5 ml por pozo
   • 10 cm placa de 1 ml por placa
   • 15 cm placa de 1 ml por placa
4. Después de la lisis, utilice un rascador de células para recoger las células de la placa. Asegúrese de mantener lisados ​​en hielo para minimizar la actividad de la proteasa
5. Lisados ​​celulares girar durante 15 minutos a 4 ° C en una sobremesa mini-centrífuga a toda velocidad (15.000 xg).
6. Pipeta el sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche el sedimento.
7. Analizar los niveles de proteína y proceder con la inmunoprecipitación.

6. Preparación de inmuno-magnética bolas Precipitaciones

Nota: Este paso se suele iniciar directamente después del inicio de la incubación de entrecruzamiento de 2 horas.

1. Combine 30 l de Dynal bolas inmunomagnéticas, 500 l de tampón IP (1x tampón A + 0,1% Triton X-100) y la cantidad apropiada de antígeno-anticuerpo específico de rosca para tubos de microcentrífuga. Prepare libre de anticuerpos y no específica de anticuerpos para los tubos de los controles negativos. La cantidad apropiada de anticuerpos se determina en base a los antígenos en experimentos separados. Marque todos los tubos de propiedad intelectual.
2. Permita que los tubos de IP para la incubación de un rockero de extremo a extremo a temperatura ambiente durante dos horas. Por otra parte, incubar los tubos IP con anticuerpos noche a 4 ° día antes de la reticulación.
3. Después de la incubación, hacer una rápida 10 segundos mini-centrifugación para recoger las gotas en la parte inferior del tubo.
4. Deslice los tubos en el soporte magnético, que se tire de la partículas magnéticas de la parte inferior del tubo. Con las cuentas de forma segura fuera del camino, ahora puede fácilmente eliminar cualquier anticuerpo no unido.
5. Use una pequeña propina aspirador dio como una punta de carga de gel, o p200 punta para quitar el tampón de incubación y cualquier anticuerpo no unido. Tan pronto como el volumen de incubación se retira en añadir 1 mL de tampón IP.
6. Tapar el tubo, con cuidado volver a suspender las cuentas, e incubar todos los tubos de IP a temperatura ambiente durante 5 minutos con final sobre el extremo de rotación.
7. Repita el paso de lavado de 5 minutos (pasos 6.3 a 6.6), una vez más con un mililitro de tampón fresco IP.
8. Los tubos IP puede permanecer en la incubación, lavar durará hasta el lisado reticulado está listo para ser añadido a las perlas.

7. Incubar lisado reticulado con inmuno-magnética Cuentas

1. Después del último lavado de giro inmuno-magnética cuentas, en un mini-centrifugar durante 10 segundos. A continuación, proceder a caer los tubos en el soporte magnético.
2. Una vez más, con una pequeña propina aspiración agujero, quitar el volumen de incubación del tubo. Inmediatamente añadir 500 l de lisado celular reticulado (suponiendo lisado a 1 mg / ml) a los tubos que contienen inmuno-magnética cuentas. Si va a utilizar la competencia de péptidos como control negativo, una cantidad adecuada de péptido se debe incluir en este punto. Los experimentos anteriores se debe realizar para determinar las condiciones de competencia adecuadas péptido. Alternativamente, usted puede querer tener lisado libre inmuno-magnética cuentas como control negativo. En este caso, inmediatamente añadir 500 l de lisado buffer (1x tampón A + 0,5% Triton X-100) + completa de las cuentas de inmuno-magnética.
3. Resuspender suavemente las bolas. Microesferas resuspendidas se incubaron a 4 º en una rotación de extremo a extremo durante 2 horas.

8. Lave lisado consolidar de Cuentas

1. Una vez lisado ha tenido tiempo de incubación suficiente, hace un rápido giro 10 segundos en un mini-centrifugadora. A continuación, deslice los tubos en el soporte magnético. El soporte magnético se debe mantener en un baño de hielo durante el resto del experimento.
2. Usando una pequeña punta del aspirador dio, quite todas las lisado no consolidados. Inmediatamente después de todo lisado no unido se elimina añadir 1 ml de tampón de IP.
3. Tape el tubo y suavemente volver a suspender las bolas.
4. Cuando los granos se resuspendió repetir el paso de granulación de cuentas (8,1).
5. Una vez más aspirado de todo el volumen de incubación y de inmediato agregar 1 ml de buffer de propiedad intelectual, a continuación, tapar el tubo.
6. Resuspenda suavemente los granos en el tampón de IP. Incubar microesferas resuspendidas durante 5 minutos a 4 ° con el de extremo a extremo balanceo.
7. Repita los pasos de lavado de grano (8.4 a 8.6) 4 veces más.

9. Desnaturalizar la muestra y la Colecta de Cuentas

1. Después de todos los tubos de precipitación inmuno-magnética han sido lavados, sedimentos volver a las cuentas (8,1) y las trompas de caer en lasoporte magnético.
2. Proteínas unidas a las perlas inmuno-magnéticas se eliminan en condiciones de desnaturalización. Aspirar fuera del lavado IP Buffer pasado y retirar el tubo de IP del soporte magnético.
3. Añadir 1x tampón de la muestra de gel en el tubo de IP justo por encima de la pastilla a la piscina de bolas las cuentas en la parte inferior del tubo de nuevo. La cantidad de tampón de la muestra depende del tamaño y del gel que se utiliza. Es posible que deba golpear suavemente la parte inferior del tubo para obtener todas las cuentas se resuspendieron en el tampón de la muestra de gel.
4. Repita el proceso de desnaturalización (9,2 por 9,3) para cada tubo IP.
5. Inmuno-magnética microesferas resuspendidas en tampón de gel de la muestra se calienta a 75 ° C durante 5 minutos para completar el proceso de desnaturalización.
6. Una vez que la muestra ha sido desnaturalizada que se puede ejecutar en un gel de SDS-PAGE para el Western Blot. Vaciado Inmuno-Magnética bolas se puede volver a sedimentaron por centrifugación y se retira de la muestra con el soporte magnético.

10. Elución de los complejos entrecruzados con péptidos antigénicos (cromatografía de inmunoafinidad).

1. Después de todos los tubos de inmunoprecipitación inmuno-magnética han sido lavados, sedimentos volver a las cuentas (8,1) y las trompas de diapositiva en el soporte magnético. Aspirar el sobrenadante y añadir 10 l de tampón A complementado con el péptido antigénico reconocido por el anticuerpo utilizado para immunoisolation de complejos de proteínas. Usted debe probar concentraciones que van desde 10 hasta 200 M para elución eficiente.
2. Incubar las cuentas durante 2 horas a 4 ° C.
3. Poner cuentas en el soporte magnético y con mucho cuidado recuperar los 10 ml de material eluido. Guardar este sobrenadante.
4. Lave rápidamente las cuentas con un Buffer y deseche el lavado. Salvar las cuentas.
5. Añadir Buffer Gel de muestra para guardar el sobrenadante y cuentas a una concentración de 1x. Incubar los tubos a 75 ° C durante 5 minutos.
6. Analizar cuentas y eluido péptido por SDS-PAGE. Que el efluente debe estar libre de IgG, tanto por tinción de proteínas de la SDS-PAGE o por immunoblots (fig. 1B). Este material libre de IgG es adecuado para la espectrometría de masas.

Figura 1. El aislamiento de AP-3 complejos de proteínas que interactúan y proteínas de la membrana. HEK293 (A) o las células PC12 (B) fueron tratados en la presencia de control del vehículo (DMSO, extraño carriles Fig. 1A) o DSP (incluso carriles fig. 1A o todos los carriles en la Fig. 1B). Extractos se incubaron ya sea aclarado con cuentas solo (Fig. 1A, carriles 3-4), los anticuerpos del receptor de transferrina (Fig. 1A, carriles 5-6), o AP-3 anticuerpos δ (Fig. 1A, carriles 7-10; Fig. . 1B, carriles 1-10). Los complejos inmunes se eluyeron con tampón de muestra SDS-PAGE (Fig. 1A), un tampón solo o (Fig. 1B, carriles 1-2), o un tampón suplementado con concentraciones crecientes del péptido antigénico δ correspondientes a los aminoácidos 680 710 de los derechos humanos δ-adaptin (NCBI: AAD03777; GI: 1923266) (Fig. 1B, carriles 30-10). Este péptido se une al anticuerpo δ. Tras la elución de péptidos, los sobrenadantes (S) y cuentas (B) se analizaron por inmunoblot (Fig. 1B). AP-3, que se detecta con anticuerpos contra el δ, β3, y las subunidades σ3, coprecipitados con los siguientes factores solubles: la cadena pesada de clatrina (CHC), del BLOC-1 pallidin subunidad, y la subunidad vps33b LÚPULO complejo, así como la membrana de proteínas fosfatidilinositol-4-quinasa tipo II alfa (PI4KIIα) y el transportador de zinc 3 (ZnT3). Nótese la ausencia de IgG de ratón cadenas pesadas en el péptido eluido sobrenadante de la figura. 1B.

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Discusión

DSP, una membrana permeable, reticulante químicamente reduce con un brazo espaciador de 12 A se utiliza para estabilizar las interacciones proteína transitoria ^1,2,3,4. Aquí se ejemplifican esta estrategia con el complejo adaptador AP-3 un complejo de proteínas solubles, que reconoce y clasifica las proteínas de membrana en vesículas de endosomas ^5. AP-3 se une selectivamente al transportador de zinc ZnT3 y la quinasa de lípidos fosfatidilinositol-4-quinasa alfa de tipo II, pero no del recep...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	P4417	Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM
Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22585	Moisture sensitive, store in air tight container 4°C
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
Triton X-100, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	T9284
Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG	Invitrogen	110.31	Beads are also available as sheep anti-rabbit
Dyna-Mag-2 magnet	Invitrogen	123-21D