El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

Resumen

El efecto de la rigidez del sustrato en la función celular puede ser modelada In vitro Utilizando los hidrogeles de poliacrilamida de diferentes incumplimientos.

Resumen

La rigidez del tejido es un factor determinante de la función celular, y cambios en la rigidez del tejido son comúnmente asociados con la fibrosis, cáncer y enfermedades cardiovasculares ^1-11. Los enfoques tradicionales de biología celular al estudio de la función celular implica el cultivo de células sobre un sustrato rígido (platos de plástico o de vidrio cubreobjetos), que no puede explicar el efecto de una ECM elástica o las variaciones en la rigidez de ECM entre los tejidos. Para crear un modelo in vivo las condiciones del tejido cumplimiento in vitro, y otros utilizan ECM-revestidos hidrogeles. En nuestro laboratorio, los hidrogeles se basan en la poliacrilamida que puede imitar la serie de incumplimientos del tejido biológico visto ^12. "Reactiva" cubreobjetos son generados por la incubación con NaOH seguido por la adición de 3-APTMS. El glutaraldehído se utiliza para reticular el 3-APTMS y el gel de poliacrilamida. Una solución de acrilamida (AC), bis-acrilamida (Bis-AC) y persulfato de amonio se utiliza para la polimerización del hidrogel. N-hidroxisuccinimida (NHS) se incorpora a la solución de CA para reticular las proteínas ECM al hidrogel. Después de la polimerización del hidrogel, la superficie del gel está recubierto con una proteína de elección ECM como la fibronectina, vitronectina, colágeno, etc

La rigidez de un hidrogel puede ser determinada por la reología o microscopía de fuerza atómica (AFM) y ajustado variando el porcentaje de AC y / o AC-bis en la solución ^12. De esta manera, la rigidez sustrato se puede adaptar a la rigidez de los tejidos biológicos, que también puede ser cuantificado usando la reología o AFM. Células pueden ser sembradas en estos hidrogeles y cultivadas según las condiciones experimentales necesarias. Imágenes de las células y su recuperación para el análisis molecular es sencillo. Para este artículo, se define sustratos blandos como los que tienen módulos de elasticidad (E) <3000 Pascal y sustratos rígidos / tejidos como aquellos con E> 20.000 Pascal.

Protocolo

Preparación

• Cubreobjetos deben ser esterilizados en autoclave.
• Agua destilada estéril o desionizada se debe utilizar para preparar las soluciones y cubreobjetos de lavado.
• CA (40% w / v) y bis-CA (1% w / v) se esterilizan por filtración 0,2 um. Prepare un 10% de persulfato de amonio (APS, el agua 100μg/ml) poco antes de su uso y filtro estéril. Sustituir la solución APS mensuales.
• Reactivos químicos como el 3-APTMS, cloroformo, glutaradehyde, NHS, y SurfaSil que no pueden ser esterilizados en autoclave se mantienen en una botella asignados utilizados únicamente para la preparación de los hidrogeles.
• Para obtener mejores resultados, los hidrogeles se deben utilizar dentro de un par de días después de la incubación durante la noche con la proteína adecuada ECM.
• Prepare una solución SurfaSil 10% en cloroformo (10 ml es suficiente para 20 cubreobjetos arriba) en un tubo de 50 ml de polipropileno Falcon antes de verter de hidrogel. (Nuestro laboratorio por lo general siliconizes el cubreobjetos encima durante la etapa de incubación glutaraldehído 0,5%). Agregue el cubreobjetos en el tubo Falcon y el rock por lo menos 10 min. Decantar la solución SurfaSil y secar al aire los cubreobjetos en Kimwipes en la cabina de seguridad biológica en los hidrogeles se preparará.
• Prepare la solución de BSA inactivado por calor de la siguiente manera: a 20 mg / ml de solución de ácidos grasos libres BSA en PBS se incuba en un baño de agua 68 ° C durante 30 min. La solución se filtra de manera estéril y se almacenan a 4 ° C.

Procedimiento

1. Coloque una capa de Parafilm en la mitad inferior de un plato de Petri de 150 mm.
2. Lugar hasta 9 de 25 mm cubreobjetos en la parte superior de la Parafilm y cubrir con 1 ml de NaOH 0,1 M. Incubar durante 3 minutos y luego aspire con una línea de vacío.
3. Trabajo en una campana química, lugar de 0,5 ml de 3 APTMS en cada portaobjetos. Incubar durante 3 minutos y luego aspirar el APTMS. Si usted espera demasiado tiempo, una forma de espuma.
4. Enjuague el cubreobjetos una vez con 20 ml de agua desionizada en el mismo plato. Quitar los cubreobjetos de la cápsula, utilizando pinzas curvas y la transferencia de ellos, con sus tratos hacia arriba, a un nuevo plato de 150 mm. Lavar los cubreobjetos con agua destilada tres veces, en la mecedora, durante 10 minutos cada lavado. Si usted no puede eliminar todos los APTMS, reaccionará con el glutaraldehído en el siguiente paso y dejar un precipitado blanco turbio (Figura 1).
5. Descongele el glutaraldehído (~ 10 min antes de su uso).
6. El uso de pinzas curvas, la transferencia de los cubreobjetos de un plato limpio en capas con Parafilm y se aspira el líquido restante. Use una línea de vacío o Kimwipe para secar el agua restante, según sea necesario.
7. Cubra cada portaobjetos completamente con 0,5 ml de 0,5% de glutaraldehído en agua destilada estéril y se incuba durante 30 minutos en una campana química. Aspirar el glutaraldehído. Enjuague y lave el cubreobjetos como en el paso 4. Seque el cubreobjetos por completo. [Se puede parar aquí y dejar el cubreobjetos durante varias semanas en un lugar seco].
8. Cuando esté listo para preparar los hidrogeles, use pinzas curvas de transferencia de los cubreobjetos, por parte reactiva, con una lámina de Parafilm que ha sido grabado en la superficie de la cabina de seguridad biológica. Asegúrese de que los cubreobjetos son planas en la superficie de Parafilm.
9. Prepare una solución saturada de NHS en tolueno. (Disolver una pequeña cantidad de NHS en tolueno suficiente para una experiencia particular. Continúe agregando poco a poco hasta NHS del SNS no se disuelve. La solución saturada es generalmente nublado y rosa.)
10. A continuación, preparar la acrilamida, bis-acrilamida, el agua y el APS para alcanzar el porcentaje deseado de acrilamida. Añadir los reactivos en tubos de microcentrífuga como se indica a continuación para un volumen total de 0.8ml.
11. A continuación, una alícuota a la vez, añadir el NHS y TEMED a la solución 0,8 ml de CA, vortex brevemente y vierta inmediatamente 3-5 geles con 140 l por cubreobjetos en la campana de seguridad biológica. Siempre que sea posible, todas las medidas desde este punto se debe realizar en una cabina de seguridad biológica. [Nota: cubreobjetos de diferentes tamaños pueden ser utilizados basado en las necesidades. Si de 18 mm cubreobjetos son utilizados, el uso ~ 33 l solución de CA por cubreobjetos y un cubreobjetos de 18 mm con silicona la parte superior.]
    

    	Bis-AC (%)
    	0,3 (rígido)	0.15	0.06	0,03 (suave)
    	l	l	l	l
    De agua	402	522	594	618
    Corriente alterna	150	150	150	150
    Bis-AC	240	120	48	24
    APS	8	8	8	8
    TEMED	1	1	1	1
    NHS	228	228	228	228

12. Rápidamente el lugar de la silicona de 25 mm cubreobjetos en la parte superior de cada gel antes de que comience a polimerizar. Además del cubreobjetos superior debe permitir que el aire acondicionado para cubrir completamente el fondo cubreobjetos. Incubar este "sandwich" a temperatura ambiente hasta que la AC se polimeriza. (Consulte la solución residual de CA en el tubo de microcentrífuga para determinar cuándo se ha producido la polimerización. Por lo general, unos pocos minutos para geles rígidos y un poco más de tiempo para los blandos será suficiente.).
13. Recoja cuidadosamente el bocadillo (guantes estériles sobre!) Y deslice la parte superior cubreobjetos hasta que sobresale por encima del gel polimerizado. A continuación, puede que saque el gel. Si usted espera demasiado tiempo antes de retirar el cubre la parte superior, el gel de rasgar el cubreobjetos se retira.
14. Desechar el portaobjetos superior. Coloque la parte inferior de gel cubreobjetos (en adelante, el hidrogel) en placas de 6 pocillos con 2 ml de PBS / pocillo. PBS se puede añadirse antes o después de la gel-cubreobjetos a cada pocillo. Lavar los hidrogeles con PBS tres veces, en una mecedora, a 5 min por lavado.
15. Repita los pasos 11-14 hasta que el número requerido de hidrogeles se han preparado.
16. Cubrir cada uno de hidrogel con 2 ml de una solución de fibronectina (3 mg / ml en PBS) o proteínas ECM otros (véase Klein et al. ¹³ para más detalles.). La proteína ECM se convierte en enlace covalente al hidrogel durante la incubación durante la noche a 4 ° C.
17. Aspirar la solución de ECM y el bloque del SNS no ha reaccionado con 1mg/ml inactivado por calor, los ácidos grasos libres BSA en medio libre de suero durante al menos 30 minutos a 37 ° C en un cultivo celular incubadora. Enjuague los hidrogeles una vez con PBS estéril o medio de cultivo celular.
18. Células de la placa en el medio de cultivo adecuado que contiene FBS. El número de células sembradas en el hidrogel debe ser determinado por el usuario en función del grado de difusión celular y la confluencia necesaria para la experimentación. Aproximadamente 10 ⁵ células suele ser suficiente para el análisis de Western Blot y qPCR.
19. Tras el período de incubación, las proteínas celulares o ARNm se puede extraer. Los cubreobjetos se retira cuidadosamente de los pozos con pinzas curvas y se colocan (las células hacia abajo) en la parte superior de las gotas de 100 l de buffer de lisis que se han espaciado (2 a 3 cm) a lo largo de una lámina de Parafilm sobre la mesa del laboratorio. (Utilizamos estándar SDS muestra de amortiguación y TRIzol, respectivamente, para preparar las muestras para el Western Blot y para aislar ARN de qPCR.) Se incuban las células con el tampón de lisis de exactamente un minuto. Quitar los cubreobjetos y la transferencia de la solución amortiguadora de lisis de un tubo de microcentrífuga. Como alternativa para la extracción de ARN sólo, el usuario puede transferir cada hidrogel a una nueva de 6 pocillos y añadir 1 ml de TRIzol / bien. Incubar durante 3 minutos y retirar la solución para el almacenamiento de TRIzol en un tubo de microcentrífuga.

Información adicional sobre los procedimientos, como la inmunofluorescencia, la tinción de BrdU, transfección, etc para que las células sembradas en hidrogeles se describe en Klein et al. 2007 ^13.

Resultados representante

Limpieza a fondo de los cubreobjetos tras la adición de APTMS es un paso importante en la producción de "reactivo" cubreobjetos. Si uno no puede quitar la APTMS por completo, es el que reacciona con el glutaraldehído en el paso siguiente y producir un precipitado de color blanco turbio como se ve en la figura 1A. La figura 1B muestra un cubre adecuadamente lavado y secado. Si el precipitado se desarrolla todo el proceso debe reiniciarse desde el principio como el cubreobjetos ya no es utilizable.

Después de la formación del hidrogel y el recubrimiento con las proteínas ECM durante la noche, las células se pueden sembrar al día siguiente. Como muestra la Figura 2 se muestra, hay una clara diferencia entre la propagación de células en comparación con los hidrogeles rígidos blandos. Como se puede observar mediante la tinción phalloidin en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), las células se extendió a un mayor grado de rigidez en comparación con los hidrogeles blandos. De hecho, la mayoría de las células correspondientes a un hidrogel blando son compactas y dan menos eficiente.

Aunque sólo la morfología MEF se muestra en la Figura 2, la diferencia de la propagación de células es consistente a través de varias líneas celulares de otras pruebas ^11-12,14.

Secretos para el Éxito

1. Una vez que el procedimiento se ha iniciado, es muy importante mantener el cubreobjetos con el "reactivo" hacia arriba y tener en cuenta de qué lado se ha revestido.
2. Se deben usar guantes en todo momento durante el procedimiento para proporcionar un ambiente de trabajo que es tan estéril como sea posible.
3. La mayor parte de los primeros pasos se llevan a cabo entre una campana para vapores químicos y el banco de laboratorio. Todos los pasos posterioresa eliminar el exceso de glutaraldehído los cubreobjetos debe efectuarse en una cabina de seguridad biológica.
4. Debido a las diferencias en la propagación de células (Figura 2), se recomienda la siembra de dos veces el número de células en hidrogel blandas en comparación con los hidrogeles rígidos.
5. El proceso de polimerización de CA es extremadamente rápido. Para los usuarios de primera vez, se puede disminuir la cantidad de APS o TEMED en la solución para prolongar el proceso de polimerización. No trate de preparar más de un cubreobjetos de unos pocos a la vez.
6. En los estudios de ciclo de la célula donde se requiere sincronización en G0, por lo general el suero de hambre las células en placas de cultivo de plástico, trypsinize las células y resembrar en los hidrogeles de cumplimientos diferentes, en presencia de mitógenos (FBS y / o factores de crecimiento). Este procedimiento asegura que la población a partir de G0-sincronizado células es idéntico en todas las muestras. Sin embargo, para muchos estudios de transducción de señales, el período de estimulación por mitógenos requerida no puede ser lo suficientemente largo para permitir que el apego y la propagación de las células. En este caso, el suero de hambre las células de los hidrogeles y luego directamente a estimular con mitógenos.

Figura 1A. Inapropiadamente lavados cubreobjetos. Tras la adición de APTMS, cubreobjetos se lavó durante 1-2 minutos antes de la adición de la solución de glutaraldehído. El precipitado se forma en el cubreobjetos que no haya sido lavado de acuerdo a los pasos descritos en el procedimiento.

Figura 1B. Lavados cubreobjetos. Además Después de APTMS, cubreobjetos se lavó tres veces 10 minutos cada una antes de la adición de la solución de glutaraldehído. No precipitado forma en el cubreobjetos.

Figura 2. Morfología de las células en los hidrogeles de diferente rigidez. Establecida MEFs fueron sembradas en recubiertos de fibronectina hidrogeles de la rigidez de alta o baja durante 9 horas. Tras el período de incubación, las células fueron fijadas, permeabilized y teñidas con FITC-faloidina que se une a la F-actina. MEFs en geles de alta rigidez presentan las fibras de estrés y se extiende mucho en comparación con las sembradas en hidrogeles baja rigidez. Barra de escala = 50 micras.

Figura 3. Representante resultado de la PCR cuantitativa de los niveles de ARNm de la ciclina D1 ratón. Suero fibroblastos embrionarios de ratón muerto de hambre fueron chapados en alto (3% de acrilamida) o bajo (0,3% de acrilamida) hidrogeles rigidez y estimulados con FBS al 10% durante 9 horas. Tras la extracción de ARN, en tiempo real, análisis de PCR cuantitativa se realizó para los niveles de ARNm de la ciclina D1 (normalizado a 18S ARN). G0 representa ciclina D1 ARNm de las células en reposo. Niveles de ciclina D1 mRNA de aumentar de forma significativa en los hidrogeles rígidos, pero no en los hidrogeles blandos. Los datos son la media + / - SD de duplicar las reacciones de PCR.

Discusión

Un elemento crucial del proceso de polimerización de hidrogel es para evitar la formación de burbujas de aire que permiten que las células se unen a la cubreobjetos de vidrio en lugar de que el hidrogel ECM-revestidos en sí. Esto se puede evitar con cuidado pipeteando la solución de polimerización después de agitación y visual asegurándose que no queden burbujas de aire han quedado atrapados en el gel. Nosotros siempre recomendamos la preparación adicional "reactivo" cubreobjetos y los hidrogeles par...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	Store at -20°C
3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Store at room temperature
SurfaSil Siliconizing Fluid	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Store at room temperature
NHS (N-hydroxysucinimide Ester)	Sigma-Aldrich	A-8060	Store at 4°C Replace monthly
Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Store at 4°C
Coverslips (25mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Coverslips (18mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D