Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis

Resumo

O efeito da rigidez substratos em função celular podem ser modelados In vitro Usando hidrogéis de poliacrilamida de diferentes conformidades.

Resumo

Rigidez do tecido é um determinante importante da função celular, e mudanças na rigidez do tecido são comumente associados com câncer, fibrose e doenças cardiovasculares ^1-11. Abordagens tradicionais de células biológicas para estudar a função celular envolvem a cultura de células em um substrato rígido (pratos de plástico ou de lamínulas de vidro) que não pode explicar o efeito de um ECM elástica ou as variações de ECM rigidez entre os tecidos. O modelo em condições de tecido vivo cumprimento in vitro, nós e os outros usam ECM-revestido hidrogéis. Em nosso laboratório, os hidrogéis são baseados em poliacrilamida, que podem imitar a faixa de tecido conformidades visto biologicamente ^12. "Reativa" lamínulas são gerados por incubação com NaOH seguidos pela adição de 3-APTMS. Glutaraldeído é usado para cross-link 3-APTMS eo gel de poliacrilamida. A solução de acrilamida (AC), bis-acrilamida (Bis-AC) e persulfato de amônio é utilizado para a polimerização do hidrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) é incorporado a solução CA para crosslink proteína ECM para o hidrogel. Após a polimerização do hidrogel, a superfície do gel é revestido com uma proteína de ECM de escolha, tais como a fibronectina, vitronectina colágeno, etc

A rigidez de um hidrogel pode ser determinada por reologia ou microscopia de força atômica (AFM) e ajustado pela variação do percentual de AC e / ou bis-AC na solução ^12. Desta forma, a rigidez substrato pode ser combinada com a rigidez dos tecidos biológicos que também pode ser quantificada através de reologia ou AFM. As células podem ser semeados nesses hidrogéis e cultivadas com base nas condições experimentais necessárias. Imagem das células e sua recuperação para a análise molecular é simples. Para este artigo, definimos substratos moles como aqueles que têm módulos elásticos (E) <3000 Pascal e substratos rígidos / tecidos como aqueles com E> 20000 Pascal.

Protocolo

Preparação

• Lamínulas devem ser autoclavados.
• Água destilada ou deionizada estéril deve ser utilizada para preparar soluções e lamínulas para lavar roupa.
• AC (40% w / v) e bis-AC (1% w / v) soluções são esterilizados por filtração 0,2 mM. Prepare persulfato de amônio 10% (APS; água 100μg/ml), pouco antes de usar e filtro estéril. Substituir a solução APS mensal.
• Reagentes químicos, tais como 3-APTMS, clorofórmio, glutaradehyde, NHS, e SurfaSil que não podem ser autoclavados são mantidos em uma garrafa atribuído utilizados exclusivamente para a preparação de hidrogéis.
• Para melhores resultados, hidrogéis deve ser utilizada dentro de um par de dias após a incubação durante a noite com a proteína ECM apropriado.
• Prepare uma solução SurfaSil 10% em clorofórmio (10 ml é geralmente suficiente para 20 lamínulas superior) em um tubo de polipropileno de 50 ml Falcon antes da efusão do hidrogel. (Nosso laboratório normalmente siliconizes as lamelas top durante a etapa de 0,5% de glutaraldeído de incubação). Adicionar as lamelas ao tubo Falcon e rock durante pelo menos 10 min. Decantar a solução SurfaSil e ar seco sobre as lamelas Kimwipes no gabinete de segurança biológica, onde os hidrogéis será preparado.
• Prepare a inativado pelo calor solução BSA da seguinte forma: a 20 mg / ml solução de ácidos graxos livres BSA em PBS é incubada em banho-maria de 68 ° C por 30 min. A solução é, então, estéril filtrado e armazenado a 4 ° C.

Procedimento

1. Coloque uma camada de Parafilm na metade inferior de uma placa de Petri de 150 mm.
2. Lugar até 9 de 25 mm lamínulas em cima do Parafilm e cobri-los com 1 ml 0,1 M NaOH. Incubar por 3 min e em seguida, aspire com uma linha de vácuo.
3. Trabalhando em um capuz químico, coloque 0,5 ml de 3 APTMS em cada lamela. Incubar por 3 min e depois aspirar o APTMS. Se você esperar muito tempo, uma espuma irá se formar.
4. Lave as lamelas uma vez com 20 ml de água deionizada no mesmo prato. Retirar as lamelas do prato com a pinça curva e transferi-los, com seus tratados do lado voltado para cima, a um prato de 150 mm nova. Lavar as lamelas com água deionizada por três vezes, na cadeira de balanço, por 10 min cada lavagem. Se você não conseguir remover todos os APTMS, ele irá reagir com o glutaraldeído na próxima etapa e deixar um precipitado nublado branco (Figura 1).
5. Descongelar o glutaraldeído (~ 10 min antes do uso).
6. Utilizando uma pinça curva, as lamelas de transferência para um prato limpo camadas com Parafilm e aspirar todo o líquido restante. Use uma linha de vácuo ou Kimwipe para apagar o restante da água, conforme necessário.
7. Cobrir cada lamela completamente com 0,5 ml de glutaraldeído 0,5% em água deionizada estéril e incubar por 30 min em uma capa química. Aspirar o glutaraldeído. Lavar as lamelas como no passo 4. Seca as lamelas completamente. [Você pode parar por aqui e deixar as lamelas durante várias semanas em uma área seca].
8. Quando você está pronto para preparar o hidrogéis, utilize uma pinça curva para transferir as lamelas, de cabeça reativa, para uma folha de Parafilm que foi gravado na superfície do gabinete de segurança biológica. Certifique-se que as lamelas são planas na superfície Parafilm.
9. Preparar uma solução saturada NHS em tolueno. (Dissolver uma pequena quantidade de NHS em tolueno suficiente para o experimento particular. Continue adicionando pouco a pouco NHS até que o NHS não mais se dissolve. A solução saturada é geralmente muito nublado e rosa.)
10. Em seguida, preparar a acrilamida, bis-acrilamida, água e APS para atingir o percentual desejado de acrilamida. Adicionar os reagentes em tubos de microcentrífuga, conforme descrito abaixo para um volume total de 0.8ml.
11. Então, uma alíquota de cada vez, adicione o SNS e para o Temed 0,8 ml solução AC, vortex brevemente e imediatamente despeje 05/03 géis utilizando 140 mL por lamela na capa de segurança biológica. Sempre que possível, todas as medidas a partir deste ponto deve ser realizado em uma cabine de segurança biológica. [Nota: lamelas de diferentes tamanhos pode ser utilizado com base na necessidade. Se lamínulas de 18 mm são utilizadas, use ~ 33 mL de solução AC por lamínula e um de 18 mm lamela superior siliconizado.]
    

    	Bis-AC (%)
    	0,3 (dura)	0,15	0,06	0,03 (soft)
    	mL	mL	mL	mL
    Água	402	522	594	618
    CA	150	150	150	150
    Bis-AC	240	120	48	24
    APS	8	8	8	8
    Temed	1	1	1	1
    NHS	228	228	228	228

12. Rapidamente coloque a lamínula de 25 mm siliconizado em cima de cada gel antes que comece a polimerizar. Além da lamela superior deve permitir que a AC para cobrir completamente a lamela inferior. Incubar esse "sanduíche" em temperatura ambiente até que a AC polimeriza. (Verifique a solução AC residual no tubo de microcentrífuga para determinar quando ocorreu a polimerização. Normalmente alguns minutos para géis firmes e um pouco mais para os moles será suficiente.).
13. Com cuidado, pegue o sanduíche (luvas estéreis on!) E deslize a lamela superior até que pende sobre o gel polimerizado. Você pode, então, retire-o do gel. Se você esperar muito tempo antes de retirar a lamela superior, o gel vai rasgar como a lamela é removido.
14. Descartar a lamela superior. Coloque o fundo gel-lamelas (doravante denominado o hidrogel) em 6 bem-placas com 2 ml PBS / poço. PBS podem ser adicionados antes ou depois do gel lamela para cada poço. Lavar os hidrogéis com PBS três vezes, em uma cadeira de balanço, 5 min por lavagem.
15. Repita os passos 11-14 até o número necessário de hidrogéis foram preparados.
16. Cobrir cada hidrogel com 2 ml de uma solução de fibronectina (3 mg / ml em PBS) ou proteína ECM (ver Klein et al. ¹³ para detalhes.). A proteína ECM torna-se covalentemente ligado ao hidrogel durante a incubação overnight a 4 ° C.
17. Aspirar a solução de ECM e bloquear NHS não reagiu com 1mg/ml, inativado pelo calor BSA de ácidos graxos livres no soro livre de mídia por pelo menos 30 min a 37 ° C em uma cultura de células incubadora. Lavar a hidrogéis uma vez com PBS estéril ou meio de cultura celular.
18. Células placa no meio de cultura apropriado contendo FBS. O número de células inoculadas no hidrogel deve ser determinada pelo usuário com base no grau de disseminação de células e confluência necessária para a experimentação. Cerca de 10 ⁵ células é geralmente suficiente para a análise de western blot e qPCR.
19. Após o período de incubação, a proteína celular ou mRNA pode ser extraído. As lamelas são cuidadosamente retirados dos poços usando uma pinça curva e colocado (célula voltada para baixo) em cima de 100 gotas mL de tampão de lise que foram espaçadas (2-3cm) ao longo de uma folha de Parafilm na bancada do laboratório. (Nós usamos padrão tampão de amostra SDS e TRIzol, respectivamente, para preparar amostras para blotting ocidental e para isolar RNA para qPCR). Incubar as células com o tampão de lise de exatamente um minuto. Retirar as lamelas e transferir o tampão de lise a um tubo de microcentrífuga. Alternativamente, para extração de RNA somente, o usuário pode transferir cada hidrogel para uma placa de seis poços novos e adicionar 1 ml de TRIzol / poço. Incubar por 3 minutos e retire solução TRIzol para armazenamento em um tubo de microcentrífuga.

Informações adicionais sobre os procedimentos, tais como imunofluorescência, BrdU coloração, transfecção, etc para as células semeadas em hidrogéis é descrita em Klein et al. 2007 ^13.

Resultados representante

Lavagem completa das lamelas seguintes adição de APTMS é um passo importante na produção de "reativa" lamínulas. Se um falhar para remover o APTMS completamente, ele irá reagir com o glutaraldeído na etapa seguinte e produzir um precipitado branco cloudy como visto na Figura 1A. A Figura 1B mostra uma lamela adequadamente lavadas e secas. Se o precipitado se desenvolve, todo o procedimento deve ser reiniciado desde o início como a lamela não é mais utilizável.

Depois da formação de hidrogel e revestimento com proteínas ECM durante a noite, as células podem ser semeados no dia seguinte. Como a Figura 2 mostra, há uma nítida diferença entre célula se espalhando em hidrogéis duro contra macio. Como pode ser visto por phalloidin coloração em fibroblastos do ratinho embrionárias (MEFs), células se espalham em maior medida na rigidez em comparação com hidrogéis macio. De fato, a maioria das células associados a um hidrogel macia permanecerá compacta e anexar menos eficiente.

Embora a morfologia MEF só é mostrado na Figura 2, a diferença na célula se espalhando é consistente em várias linhagens de células outras testadas ^11-12,14.

Segredos para o Sucesso

1. Uma vez que o procedimento é iniciado, ele é muito importante para manter as lamelas com o lado "reativo" up e ter em mente que lado foi revestida.
2. As luvas devem ser usadas todo tempo durante o procedimento para fornecer um ambiente de trabalho que é tão estéril quanto possível.
3. A maioria dos passos iniciais são realizadas entre uma Cobertura de vapores químicos ea bancada do laboratório. Todas as etapas subseqüentes para remover o excesso de glutaraldeído as lamelas deve ser executada sob um armário de segurança biológica.
4. Devido às diferenças na célula distding (Figura 2), recomendamos semear o dobro do número de células em hidrogéis suave em comparação com hidrogéis dura.
5. O processo de polimerização AC é extremamente rápido. Para usuários de primeira vez, pode-se diminuir a quantidade de APS ou Temed na solução para prolongar o processo de polimerização. Não tente se preparar mais do que uma poucas lamelas de uma vez.
6. Em estudos do ciclo celular em G0, onde a sincronização é necessária, nós geralmente soro fome células em placas de cultura de plástico, trypsinize as células e reseed-los em hidrogéis de conformidades diferentes na presença de mitógenos (FBS e / ou fatores de crescimento). Este procedimento garante que a população de partida da G0-sincronizado células é idêntico em todas as amostras. No entanto, para estudos de transdução de sinal de muitos, o período de estimulação necessária mitógeno pode não ser suficiente para permitir a fixação e disseminação de células. Neste caso, nós soro-fome as células na hidrogéis e depois diretamente estimulá-los com mitógeno.

Figura 1A. Inadequadamente lavado lamela. Após adição de APTMS, lamínula foi lavada por 1-2 minutos antes da adição da solução de glutaraldeído. Um precipitado formulários na lamela que não tenha sido lavados de acordo com as etapas descritas no procedimento.

Figura 1B. Devidamente lavados lamela. Adição Após a APTMS, lamínula foi lavada por três vezes 10 minutos cada antes da adição da solução de glutaraldeído. Nenhum precipitado se forma na lamela.

Figura 2. Morfologia das células em hidrogéis de diferentes rigidez. Fundada MEFs foram semeadas em fibronectina revestido hidrogéis de rigidez alta ou baixa para 9 horas. Após o período de incubação, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com FITC-phalloidin que se liga ao f-actina. MEFs em gel de alta rigidez apresentam fibras de stress e são bem distribuídos em comparação com aqueles semeados em hidrogéis baixa rigidez. Barra de escala = 50 ìm.

Figura 3. Representante quantitativa resultado da PCR D1 rato ciclina níveis de mRNA. Serum fibroblastos de rato faminto embrionárias foram semeadas em alta (3% de acrilamida) ou baixo hidrogéis (0,3% de acrilamida) rigidez e estimuladas com FBS 10% para 9 horas. Após extração de RNA, análise em tempo real PCR quantitativa foi realizada para os níveis de ciclina D1 mRNA (normalizados para 18S RNA). G0 representa mRNA ciclina D1 a partir de células quiescentes. Níveis de ciclina D1 mRNA aumentar significativamente em hidrogéis rígida, mas não em hidrogéis macio. Os dados são média + / - SD de reações duplicar PCR.

Discussão

Um elemento crucial do processo de polimerização hidrogel é evitar a formação de bolhas de ar que vai permitir que as células se ligam à lamela de vidro, em vez de o hidrogel ECM revestido em si. Isto pode ser evitado com cuidado pipetagem a solução de polimerização após vórtex e visualmente para que não se têm bolhas de ar ficam presas no gel. Recomendamos sempre a preparar adicionais "reativa" lamínulas e hidrogéis para garantir ter o suficiente para a experimentação.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	Store at -20°C
3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Store at room temperature
SurfaSil Siliconizing Fluid	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Store at room temperature
NHS (N-hydroxysucinimide Ester)	Sigma-Aldrich	A-8060	Store at 4°C Replace monthly
Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Store at 4°C
Coverslips (25mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Coverslips (18mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D