La transección del nervio óptico: un modelo de apoptosis neuronal de adultos en el sistema nervioso central

Resumen

Transección del nervio óptico es un modelo ampliamente utilizado de la lesión en el SNC adulto. El noventa por ciento de las células ganglionares de la retina (CGR) cuyos axones son completamente seccionado (axotomía) mueren dentro de 14 días después de axotomía. Este modelo es fácilmente susceptible de manipulaciones experimentales y altamente reproducible.

Resumen

Las células ganglionares de la retina (CGR) son las neuronas del SNC que la producción de información visual desde la retina hasta el cerebro, a través del nervio óptico. El nervio óptico se puede acceder dentro de la órbita del ojo y completamente seccionado (axotomized), el corte de los axones de la población RGC todo. Transección del nervio óptico es un modelo reproducible de la muerte apoptótica de las células neuronales en el SNC adulto ^1-4. Este modelo es particularmente atractivo debido a que la cámara vítrea del ojo actúa como una cápsula para administración de fármacos a la retina, lo que permite manipulaciones experimentales a través de inyecciones intraoculares. La difusión de los productos químicos a través del humor vítreo se asegura de que actúan sobre la población RGC todo. Por otra parte, la CGR puede ser selectiva transfectadas mediante la aplicación a corto RNAs de interferencia (siRNA), plásmidos o vectores virales para el corte final de los vectores del nervio óptico o la inyección de ^5-7 en su objetivo, el colículo superior ^8. Esto permite a los investigadores a estudiar los mecanismos de apoptosis en la población neuronal que desee, sin factores de confusión en las neuronas o glía espectador otras circundantes. Un beneficio adicional es la facilidad y la precisión con la que se puede cuantificar la supervivencia celular después de la lesión. La retina es un tejido plano, capas y CGR se localizan en la capa más interna, la capa de células ganglionares. La supervivencia de las CGR se pueden rastrear en el tiempo mediante la aplicación de un indicador fluorescente (3% Fluorogold) para el extremo del corte del nervio óptico en el momento de axotomía, o mediante la inyección del trazador en el colículo superior (objetivo RGC) una semana antes de axotomía. El marcador se transportan por vía retrógrada, el etiquetado de la población RGC todo. Debido a que la capa de células ganglionares es una monocapa (una célula de espesor), la densidad de RGC se puede cuantificar en el tejido plano de montaje, sin necesidad de estereología. Transección del nervio óptico conduce a la muerte apoptótica de 90% de la CGR heridos dentro de 14 días postaxotomy ^11.09. RGC apoptosis tiene una característica de tiempo-por supuesto por el que se retrasa la muerte celular postaxotomy 3-4 días, después de que las células degeneran rápidamente. Esto proporciona una ventana de tiempo para la manipulación experimental dirigida contra los involucrados en la apoptosis.

Protocolo

1. Técnica quirúrgica

1. Los experimentos deben llevarse a cabo utilizando una técnica aséptica y siguiendo los protocolos de uso de los animales de su institución específica. Instrumentos y materiales (soluciones, las sustancias químicas, marcadores, agujas, etc) que entran en contacto con el tejido vivo debe ser estéril para prevenir la infección y los efectos negativos sobre el bienestar animal y los posibles impactos negativos en el estudio.

2. Anestesia

1. Las ratas se anestesiaron con un sistema veterinario vaporizador isoflurano. El uso de oxígeno de uso médico a un ritmo de 0,8 L / min para vaporizar el gas isoflurano. Colocar el animal en el cuadro adjunto de anestesia y marcar en una concentración de isoflurano del 4% hasta que la respiración se ha desacelerado y el animal está tranquilo.
2. A continuación, cambiar el flujo de gas a la unión máscara de gas para el marco estereotáxico y el lugar del animal en el aparato estereotáxico. A su vez la concentración de isoflurano al 2% y el monitor de anestesia. Los animales más grandes (> 300 g) pueden requerir una mayor concentración de isoflurano. Anestesia deben ser controlados durante la cirugía y la dosis de isoflurano ajustarse en consecuencia. Profundidad y la velocidad de la respiración debe ser constantemente evaluados, y la evaluación de los pies de presión (cada 5 minutos) por la ausencia de dolor profundo se debe realizar.
3. Una vez terminada la cirugía, apague el isoflurano y permitir que el animal oxígeno respiración durante varios minutos antes de la remoción del dispositivo estereotáxico. La temperatura del cuerpo se debe mantener al cubrir al animal con una manta quirúrgico y / o el uso de una manta de calefacción regulada durante la cirugía.

3. Abordaje quirúrgico

1. Humedezca la piel en la parte superior de la cabeza con el 70% de etanol para hacer la piel más fácil de cortar. Retire la piel de entre los ojos con un clipper o tijera afilada. Limpie el área de la incisión tres veces con aplicaciones alternas de solución de yodo detergente (Proviodine, Betadine, etc), seguido de etanol al 70%. Mantener la córnea húmeda durante toda la cirugía mediante la aplicación de ungüento oftálmico ojo (Tears Naturale PM) a la córnea. Esparza la pomada sobre la superficie de la córnea de forma manual la apertura y cierre de los párpados.
2. Usando una hoja N º 11, hace una incisión a lo largo de la línea media de la cabeza de aproximadamente 0,5 cm por delante de los ojos a 1 cm por detrás de los ojos. Retraer el colgajo de piel sobre el ojo con las pinzas y suavemente se burlan de el tejido conectivo subyacente con la parte posterior del bisturí. A continuación, retire el colgajo de piel lateralmente y hacia abajo y mantenerla en su lugar con un retractor quirúrgico que puede ser pegado a la base del instrumento estereotáxico.
3. Hacer una incisión a lo largo del borde superior del hueso orbital mientras tira de la fascia que recubre con una pinza fuerte. Esto se retirará de la fascia que recubre la órbita del ojo. El borde del hueso orbital puede estar claramente delimitadas mediante el uso de fórceps para empujar hacia abajo en la fascia que recubre la órbita. El uso de un dispositivo de cauterio o el bisturí, la incisión seguir hacia atrás hasta el límite posterior de la órbita del ojo. El uso del hueso de la órbita superior, como una guía para la incisión. A continuación siguen los delanteros incisión hacia el límite anterior de la órbita. La incisión de la órbita superior, se hace mejor con un dispositivo de cauterio pequeños con el fin de prevenir el sangrado de los vasos subyacentes que se comunican con los senos venosos.
4. Si se produce una hemorragia varios pasos se pueden tomar. En primer lugar, aplicar presión con hisopos estériles quirúrgicos o bastoncillos de algodón. Si el sangrado continúa, aplique solución salina fría y estéril de tampón fosfato (PBS) en el área con un gotero, y mantener la presión. La hemorragia menor se detendrá después de unos segundos con este procedimiento. Si la hemorragia persiste, aplique tracción en el tejido con un bastoncillo de algodón o quirúrgica con el fin de identificar la fuente del sangrado y rápida cauterizar el vaso comprometido. Después de que el sangrado se encuentra, use frío PBS estéril para limpiar el área quirúrgica de la sangre. El área quirúrgica debe ser periódicamente limpiado de esta manera con el fin de visualizar mejor las estructuras en la órbita del ojo.
5. Una vez que la incisión se ha limpiado, el uso de fórceps y la parte posterior del bisturí para limpiar el tejido conectivo en la parte posterior del ojo que cubre el contenido de la órbita. La parte posterior del bisturí N º 11 funciona bien cuando la punta está muy bien. Esto abrirá más porciones de la cavidad orbital proporciona una ventana más grande quirúrgica para trabajar, lo Utilice Dumont 7b # afiladas curvas dentadas fórceps cuando se trabaja en el ojo como su curvatura y punta fina son ideales para la manipulación de estructuras en la órbita. Además, las estrías ayuda con las estructuras de sujeción.
6. A continuación, retirar el tejido conjuntivo que rodea a la rama oftálmica del nervio trigémino que se encuentra cerca de la línea media, y eliminar el nervio con el fórceps. Este paso no es necesario, sin embargo la eliminación del nervio proporcionará una ventana más grande de accesos en el nervio óptico en el futuro.
7. Después de la extirpación del nervio, el uso de fórceps para retraer los vasos sanguíneos por debajo y completamente cauterizar el vaso. Este paso no es necesario, sin embargo, la cauterización del vaso permite que sea movido hacia delante, creando así una ventana más grande una vez que el nervio óptico se alcanza.
8. Use un fuerte par de pinzas o fórceps que han tenido sus puntas dobladas hacia adentro para recoger con cuidado y quitar la capa delgada de tejido conectivo en los músculos extraoculares y de la glándula lagrimal. Retraer los músculos extraoculares de anterior a posterior de la órbita. Agarre la parte proximal del músculo con un par de pinzas y el uso de un segundo par de pinzas curvas dentadas vestir ojo para aplicar una tracción hacia fuera en el músculo. Asegúrese de que las pinzas de vestir los ojos se orientan en la misma dirección que el músculo cuando se tira con el fin de evitar que se desgarre. Eliminar el músculo anterior de la órbita (oblicuo superior) de esta manera. El músculo se libera desde lo más profundo dentro de la órbita y la longitud restante puede ser retirado con el fin de girar la vista hacia el exterior.
9. Repita el paso 3.8 con el músculo siguiente (recto interno) que se encuentra entre los lóbulos de la glándula lagrimal y glándula de Harder, cerca de la línea media de la superficie dorsal del ojo. Pegue los retractores para mantener la tracción en los músculos.
10. Quite con cuidado cualquier resto de tejido conectivo sobre la superficie de la glándula lagrimal y levantar la glándula hacia arriba con unas pinzas. No comprimir o exprimir la glándula. Con el fin de retirar la glándula, sólo un solo vaso en el polo posterior debe ser cauterizada. Levante el extremo posterior de la glándula hacia arriba, y luego cauterizar el vaso.
11. A continuación, girar la glándula lagrimal hacia adelante para abrir la parte posterior de la órbita y permitir el acceso sin trabas a los músculos que recubren el nervio óptico. Mantenga el área constantemente húmeda con PBS estéril y secar con paños quirúrgicos o bastoncillos de algodón.
12. El uso de pinzas afiladas, una vez más eliminar la delgada de tejido conectivo que rodea los músculos de la órbita posterior (elevador del párpado superior y recto superior) y separar los haces de músculo subyacente. Retraer los músculos de forma independiente o en conjunto, utilizando la curva dentada fórceps vestir los ojos, una vez más, tirando en línea con las fibras musculares. Fije la longitud de los músculos restantes del retractor, junto con los músculos que se retractó en los pasos 3.8 y 3.9 y la cinta por el retractor de aplicar la tracción. Un total de cuatro músculos ahora se adjuntará a la retractor. Esto hará girar el ojo hacia afuera y hacia el exterior a fin de revelar la vaina grasa que contiene que rodea el nervio óptico.

4. Acceso al nervio óptico

1. El uso de fórceps fuerte (Fine Dumont punta) para tirar hacia arriba en el tejido conjuntivo que rodea la vaina grasa del nervio óptico. Haga un corte longitudinal con tijeras pequeñas de primavera Vannas. Ampliar el corte si es necesario. La grasa contenida en la vaina va a comenzar a bulto a cabo una vez se hace el corte. A continuación, retire las capas de tejido conectivo con cuidado tirando hacia arriba desde el borde y cortar las aletas de forma de media luna de los tejidos.
2. Retire la grasa que recubre el nervio óptico mediante el uso de fórceps para extraer la grasa, mientras que el corte con las tijeras de primavera Vannas. Mantener el área limpia con PBS estéril e hisopos quirúrgico para limpiar las pequeñas cantidades de sangre que surgen de la eliminación de los tejidos.
3. El nervio óptico es visible ahora. Con el fin de acceder a los nervios, la vaina meníngea que rodea el nervio se debe quitar sin dañar la arteria oftálmica que alimenta a la retina interna. Examine el patrón vascular de la vaina meníngea con unas pinzas para girar suavemente la vaina. Busque un área desprovista de vasos sanguíneos, y que permite un corte longitudinal que se hizo en la vaina de las meninges.
4. Utilizando unas pinzas punta fina Dumont, una pizca de la duramadre y tire hacia arriba. Cerca de la base de la cuña triangular de duración que se crea, el uso de las tijeras de primavera Vannas para hacer una pequeña incisión en la vaina. Inserte la hoja inferior de la tijera en la incisión y cortar la cubierta paralela a la dirección del nervio óptico, con cuidado de no dañar los vasos con cortes laterales. Use las pinzas y las tijeras para cubrir la duración de cada lado del nervio óptico.
5. La única cobertura restante del nervio es la aracnoides. Es muy fino y transparente. Con el fin de determinar si la membrana está todavía presente, el uso de fórceps fuerte pellizcar la superficie del nervio. Es la aracnoides está presente, una pizca de la membrana y tire hacia arriba para crear una cuña triangular de tejido. Haga una pequeña incisión con la punta de las tijeras similar a la etapa 4.4. A continuación, introduzca el extremo inferior de las tijeras y hacer un corte longitudinal en la aracnoides. A continuación, use las tijeras y pinzas para cubrir el aracnoides a cada lado del nervio óptico.
6. El uso de un micro-sur-gancho gica, elevar el nervio óptico de la vaina meníngea. Pase la punta del gancho en el borde exterior del nervio y asegúrese de que el gancho se mantiene en contacto con el nervio para que no se enganchen las meninges con el gancho y accidentalmente transecto. Levante con cuidado el nervio óptico de la vaina meníngea y completamente transecto nervio detrás del punto de apoyo del gancho. El tronco seccionado el nervio óptico ahora tendrán un extremo libre, lo que permite la eliminación del gancho.
7. Si la CGR van a ser retrógrada etiquetado con el fin de cuantificar la supervivencia, coloque un pequeño trozo de espuma de gel empapada en el 3% Fluorogold (u otro trazador retrógrado) sobre el muñón del nervio seccionado óptico (ver JoVe protocolo 2.261 ).

5. Cierre y recuperación

1. Aliviar la tracción en los músculos extraoculares y volver los ojos a una posición neutral. Al hacerlo, asegúrese de empujar el gelfoam abajo en la órbita del ojo para asegurarse de que la vista se gira en su lugar, la espuma de gel se mantiene alrededor del tronco del nervio óptico. Volver a la glándula lagrimal y los músculos oculares adicionales a su posición natural.
2. Devolver el colgajo de piel a la línea media y la sutura de la herida. Aplique un ungüento oftálmico ojo en ambos ojos. A continuación, apague la fuente de isoflurano y permitir que el animal oxígeno respiración durante varios minutos. Colocar el animal en una jaula o una jaula con calefacción por debajo de una lámpara de calor para recuperarse. No ponga la ropa de cama en la jaula de recuperación para eliminar la posibilidad de aspirar camas durante la recuperación.
3. Los animales deben ser alojados de manera independiente después de la cirugía. Nota analgésicos quirúrgica se debe administrar de acuerdo con las directrices de las autoridades de su cuidado de los animales y los animales deben ser controlados cuidadosamente después de la cirugía.

6. Los resultados representativos:

Sección transversal de los resultados del nervio óptico en la pérdida del 90% de la CGR heridos dentro de 14 días postaxotomy ^09.11. El principal mecanismo de la muerte de las CGR es la apoptosis ^{9, 12.} La densidad normal de la CGR es de aproximadamente 2.500 células / mm ^2. De imagen confocal de epifluorescencia o se puede utilizar para visualizar CGR retrógrada etiquetado después de axotomía. RGC apoptosis es un retraso de aproximadamente 4 días después de axotomía, dejando una ventana de tiempo para la manipulación experimental. En un día después de axotomía y etiquetado retrógrada con Fluorogold, organismos RGC células en la capa de células ganglionares de la retina y fascículos de axones en la capa de fibras nerviosas de la retina son claramente visibles cuando la imagen de una preparación flatmounted (Fig. 1a). A los 14 días después de axotomía, la mayoría de la CGR han muerto, y una pocas CGR se intercalan entre la retina microglia (Fig 1b). Cuando CGR someterse a la apoptosis, la microglía fagocitar las células muertas, y como resultado se transcellularly marcado con el marcador fluorescente que se utiliza para etiquetar la CGR ^{13, 14.} La aparición del marcador en el fagosomas de la microglía es diferente de la CGR supervivientes. Microglia contienen el marcador en fagosomas muy concentrados y extremadamente brillantes, que son relativamente grandes y dispersos en el citoplasma (Fig. 1c). CGR tiene un patrón más difuso de tinción (Fig. 1c), con pequeñas vesículas puntiformes que han sido transportados por vía retrógrada sus axones presentación del citoplasma celular. Estas vesículas son mucho más pequeñas y tienen menos intensa fluorescencia que permite a uno diferenciar CGR supervivientes de la microglia. Por otra parte, la microglía tiene mucho más pequeños cuerpos celulares y tienden a tener una morfología estrellada o ameboide a diferencia de la CGR que han cuerpos celulares relativamente grandes y redondeados. Los árboles dendríticas de la CGR también puede ayudar a diferenciarlos de los procesos a corto brillante de la microglía, la hora de cuantificar la supervivencia celular. La supervivencia celular se puede cuantificar en diferentes regiones de la retina y la densidad (células / mm ²⁾ se pueden extrapolar de la zona de las micrografías correspondientes, ya que la CGR se encuentra en una monocapa en la capa de células ganglionares.

Figura 1. Micrografías de epifluorescencia Fluorogold CGR etiqueta después de axotomía y la aplicación del trazador en el muñón del nervio óptico. (A) 1 día después de axotomía CGR y sus fascículos axón se etiquetan con el marcador de forma puntiforme bien. (B) A los 14 días después de axotomía, el 90% de la CGR han muerto y etiquetado brillantes microglia que han fagocitado células muertas están catalogadas por el marcador. (C) Mayor aumento que ilustra la diferencia entre la CGR y la microglia (puntas de flecha de color rojo) a los 14 postaxotomy días. Barra de escala en A y B es de 50 micras. Barra de escala en la C es de 25 micras.

Discusión

Hay muchas variaciones de este procedimiento quirúrgico, y varios de los pasos de este protocolo no son necesarios. Sólo es necesario retraer los músculos que recubren el nervio óptico, con el fin de tener acceso a los nervios. Sin embargo, esto se traduce en un espacio muy limitado de trabajo alrededor del nervio haciendo que el final de las etapas críticas de la sección transversal más difícil. En ciertas situaciones es deseable para transfectar las células del tronco del nervio óptico y el espacio que ofrec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	39286
Gelfoam	Pharmacia Corporation (Pfizer)
Tears Naturale P.M.	Alcon
Proviodine	Medline Industries	MDS093945H
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
Micro surgical hook	Fine Science Tools	10062-12
Eye dressing serrated forceps	Fine Science Tools	11152-10
Dumont #7b sharp curved serrated forceps	Fine Science Tools	11270-20
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00