Aplicación de una conductancia del receptor NMDA en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica

Resumen

En este video, que muestra cómo aplicar una conductancia en una neurona dopaminérgica registrado en la configuración de célula entera, en rodajas de cerebro de rata. Esta técnica se llama la pinza dinámica.

Resumen

Los neurocientíficos estudiar la función del cerebro mediante la investigación de cómo las neuronas del cerebro se comunican. Muchos investigadores observar los cambios en la actividad eléctrica de una o más neuronas en respuesta a una entrada experimental controlado. La actividad eléctrica de las neuronas se pueden grabar en rodajas de cerebro aislado utilizando técnicas de patch clamp con micropipetas de vidrio. Tradicionalmente, los investigadores pueden simular la entrada neuronal mediante la inyección de corriente a través de la pipeta, la estimulación eléctrica de las células de otros o resto de conexiones axonal en el corte, o la manipulación farmacológica de los receptores situados en la membrana de la célula neuronal registrada.

Inyección de corriente directa tiene la ventaja de transmitir una forma de onda predeterminada actual con una precisión temporal de alta en el lugar de la grabación (por lo general el soma). Sin embargo, eso no cambia la resistencia de la membrana neuronal, como no hay canales de iones son físicamente abierto. Inyección de corriente por lo general emplea pulsos rectangulares y por lo tanto no modelar la cinética de los canales iónicos. Por último, la inyección de corriente no pueden imitar los cambios químicos en la célula que se produce con la apertura de los canales iónicos.

Receptores pueden ser físicamente activa por estimulación eléctrica o farmacológica. El experimentador tiene una buena precisión temporal de la activación del receptor con la estimulación eléctrica de la división. Precisión sin embargo, no se limita espacial de la activación del receptor y la naturaleza exacta de lo que se activa por estimulación es desconocida. Este último problema puede reducirse en parte mediante agentes farmacológicos específicos. Por desgracia, el curso temporal de la activación de los agentes farmacológicos suele ser lenta y la precisión espacial de las entradas registradas en la celda se desconoce.

La técnica de la pinza dinámica permite un experimentador para cambiar la corriente pasa directamente a la celda sobre la base de información en tiempo real del potencial de membrana de la célula (Robinson y Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Para revisión, ver Prinz et al. 2004). Esto permite que un experimentador para imitar los cambios eléctricos que ocurren en el lugar de la grabación en respuesta a la activación de un receptor. En tiempo real los cambios en la corriente aplicada se determina por una ecuación matemática implementado en el hardware.

Recientemente, hemos utilizado la técnica de la pinza dinámica para investigar la generación de ráfagas de potenciales de acción por la activación fásica de los receptores NMDA en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. En este vídeo, que muestran los procedimientos necesarios para aplicar una conductancia de los receptores de NMDA en la neurona dopaminérgica.

Protocolo

1. Preparación Cortar

1. Cortar rodajas de cerebro usando un micrótomo de vibración. Hemos preparado 240 micras cortes horizontales del cerebro medio de una isoflurano anethetized ratas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) usando un microtomo vibrante (Microm HM 650V), de acuerdo con la Universidad de Texas en San Antonio de Cuidado de Animales institucional y el empleo.
2. Mantenga los segmentos en una cámara de incubación hasta que esté listo para grabar. Utilizamos un recipiente de incubación se calienta a 32 ° C y lleno de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, en mM): NaCl 126, KCl 2,5, 1,25 NaH ₂ PO _4, 4 MgCl _2, 2 _CaCl2, 10 de dextrosa, 25 _de NaHCO3, 1,3 de ácido ascórbico, 2,4 piruvato de sodio y glutatión 0,05.

2. Registro electrofisiológico

1. La transferencia de la división para el equipo de grabación intracelular en el que un líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) a 35 ° C se perfundidos. Nosotros utilizamos la misma que en LCRa 1,2 excepto que 2mM de MgCl ₂ fue utilizado y el glutatión se omitió. Para cortes en horizontal preparada, que normalmente atraviesan el corte a lo largo de la línea media.
2. Visualizar la neurona diana. Visualizamos cada sustancia negra neuronas dopaminérgicas con un sistema de gradiente de contraste de imagen.
3. Tirar de un electrodo con un extractor de electrodos electrónicos. Tiramos los electrodos con una resistencia de punta de 4.10 mW con un extractor P97 Micropipeta (Compañía Sutter Instrument).
4. Llenar un electrodo con la solución interna deseada. Utilizamos una solución que contiene (en mM): 138 K-gluconato, 10 HEPES, 2 MgCl _2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl _2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. La solución interna se ajustó a un pH de 7,3 con KOH 1M y una osmolaridad de 270-275 MOSMS.
5. Hacer un sello gigaohm en la neurona que desee. La ruptura con el sello de succión. Esto constituye un registro de células enteras. Un amplificador de MultiClamp 700B se utiliza en nuestra configuración. El amplificador debe ser colocado en el modo de pinza de corriente de la 'I = 0'.

3. Conductancia de aplicación con pinza dinámica

1. RTXI (www.rtxi.org) fue ejecutado en la computadora pinza dinámica. Un modelo personalizado por escrito que contiene un receptor de NMDA se ha cargado en la memoria. La corriente que se inyecta en las células en tiempo real se calcula por la siguiente ecuación:
   I = _{NMDA NMDA-g} * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * e ^(-V _m ^{* 0.062))]} * (V _m - E _NMDA) donde g es la conductancia _NMDA deseada (en ns; por defecto es 0 ns), [Mg] es la concentración de magnesio (se establece en 1,5 mM en el ejemplo a continuación), E _NMDA es el potencial de inversión para el receptor de NMDA (a 0 mV), y V _m es el potencial de membrana de la célula de medida desde el amplificador (en milivoltios).
2. La salida de la computadora pinza dinámica se conecta a la entrada de comandos del amplificador a través de un convertidor de analógico a digital.
3. El amplificador se coloca en modo de pinza de corriente de la "IC".
4. Ingrese su conductividad deseada del receptor NMDA en RTXI (por ejemplo, 40 ns). Usted debe ver una explosión fásica de potenciales de acción. Por otra parte, la conductancia se puede dar a través de RTXI una salida analógica (Figura 1, 'g (t)'). Un factor de escala apropiado debe ser utilizado dentro de RTXI para convertir la señal de voltios a Siemens.

4. Resultados representante

Una configuración de éxito para la aplicación de una conductividad usando la pinza dinámica se muestra en la Figura 1. Con esta instalación, hemos hecho una célula somática toda la grabación de una neurona dopaminérgica en la sustancia negra pars compacta. Las células dopaminérgicas general inflama espontáneamente en las tarifas bajas con un patrón similar al marcapasos. Una ráfaga de potenciales de acción puede ser provocado por la aplicación fásica de una conductancia del receptor NMDA con pinza dinámica (fig. 1B).

Figura 1: Aplicación de una conductancia de los receptores NMDA mediante la técnica de la pinza dinámica. Configuración de hardware A. ilustra las conexiones entre el equipo de registro intracelular y el ordenador pinza dinámica. B. Una ráfaga de potenciales de acción es provocada por la aplicación de una conductancia de los receptores NMDA 40ns en una grabación de células enteras de una sustancia negra pars compacta dopaminérgicos neurona.

Discusión

La técnica de la pinza dinámica demostrado aquí mejora de la técnica tradicional de la inyección de corriente continua al permitir que el experimentador para imitar los efectos eléctricos de la activación de un receptor. En este video, nos han demostrado que se puede añadir los efectos de la activación de un receptor de NMDA en la actividad espontánea de las neuronas dopaminérgicas, es decir, una ráfaga de potenciales de acción son evocados.

Debido a la flexibilidad de la aplicación de hardware / software, una variedad de extensiones se pueden utilizar. El signo de la corriente inyectada se puede cambiar de negativo a positivo, lo que representa un escenario donde los efectos del receptor activado se elimina de una neurona. Neuronas modelo, representado en la forma de una serie de ecuaciones diferenciales, también puede ser resuelto numéricamente y permitir que el experimentador para investigar las redes pequeñas.

Materiales

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview