Application d'une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

Résumé

Dans cette vidéo, nous démontrons comment appliquer une conductance dans un neurone dopaminergique enregistrés dans la configuration cellule entière dans les tranches de cerveau de rat. Cette technique est appelée le collier dynamique.

Résumé

Les neuroscientifiques étudier le fonctionnement du cerveau en étudiant comment les neurones dans le cerveau communiquent. De nombreux chercheurs examiner les changements de l'activité électrique d'un ou plusieurs neurones en réponse à une entrée expérimentalement contrôlé. L'activité électrique des neurones peuvent être enregistrés dans des tranches de cerveau isolé en utilisant des techniques de patch-clamp avec les micropipettes de verre. Traditionnellement, les expérimentateurs peuvent imiter entrée neuronale par injection directe de courant à travers la pipette, la stimulation électrique des cellules ou encore des connexions axonales dans la tranche, ou la manipulation pharmacologique par les récepteurs situés sur la membrane de la cellule neuronale enregistrée.

Directe d'injection de courant a les avantages du passage d'un signal de courant prédéterminé avec précision temporelle élevée à l'emplacement de l'enregistrement (en général le soma). Cependant, il ne change pas la résistance de la membrane neuronale pas les canaux ioniques sont physiquement ouvert. Injection de courant emploie habituellement des impulsions rectangulaires et n'a donc pas le modèle de la cinétique des canaux ioniques. Enfin, l'injection de courant ne peut pas imiter les changements chimiques dans la cellule qui se produit avec l'ouverture de canaux ioniques.

Les récepteurs peuvent être physiquement activées par la stimulation électrique ou pharmacologique. L'expérimentateur a une bonne précision temporelle de l'activation du récepteur avec une stimulation électrique de la tranche. Cependant, il est limité précision spatiale de l'activation du récepteur et la nature exacte de ce qui est activé lors de la stimulation est inconnue. Ce dernier problème peut être partiellement atténué par des agents pharmacologiques spécifiques. Malheureusement, le cours du temps d'activation des agents pharmacologiques est généralement lente et la précision spatiale des entrées enregistrées sur la cellule est inconnue.

La technique du clamp dynamique permet un expérimentateur de changer le courant passe directement dans la cellule basée sur la rétroaction en temps réel du potentiel de membrane de la cellule (Robinson et Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Pour revue, voir Prinz et al. 2004). Cela permet à un expérimentateur pour imiter les changements électriques qui se produisent sur le site de l'enregistrement en réponse à l'activation d'un récepteur. En temps réel des modifications dans le courant appliqués sont déterminés par une équation mathématique mis en œuvre dans le matériel.

Nous avons récemment utilisé la technique du clamp dynamique pour enquêter sur la génération de salves de potentiels d'action par l'activation phasique des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques de la substantia pars compacta du locus niger (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. Dans cette vidéo, nous démontrons les procédures nécessaires pour appliquer une conductance des récepteurs NMDA dans un neurone dopaminergique.

Protocole

1. Préparation Trancher

1. Couper les tranches de cerveau à l'aide d'un microtome vibrante. Nous avons préparé 240 um tranches horizontales mésencéphale d'un isoflurane anethetized rats Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) à l'aide d'un microtome vibrant (Microm HM 650V) en conformité avec l'Université du Texas à San Antonio de protection des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation.
2. Gardez les tranches dans une chambre d'incubation jusqu'à ce que vous êtes prêt à enregistrer. Nous utilisons un récipient d'incubation chauffée à 32 ° C et remplis de liquide céphalorachidien artificiel (ACSF, en mM): 126 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH ₂ PO _4, 4 MgCl _2, CaCl 2 _2, 10 dextrose, 25 NaHCO _3, 1,3 acide ascorbique, du pyruvate de sodium 2,4 et 0,05 glutathion.

2. Enregistrement électrophysiologique

1. Transfert de la tranche de la plate-forme d'enregistrement intracellulaire dans laquelle un fluide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) à 35 ° C est perfusé. Nous utilisons les mêmes que dans aCSF 1.2, sauf que 2 mM MgCl ₂ a été utilisé et le glutathion a été omise. Pour les tranches à l'horizontale préparés, nous coupent généralement la tranche le long de la ligne médiane.
2. Visualisez le neurone cible. Nous visualisés individuels substantia nigra neurones dopaminergiques avec un système d'imagerie gradient de contraste.
3. Tirez une électrode en utilisant un extracteur d'électrode électronique. Nous tirons des électrodes avec une résistance de pointe de 4-10 MQ en utilisant un extracteur P97 Micropipette (Sutter Instrument Company).
4. Remplir une électrode avec la solution interne désirée. Nous utilisons une solution contenant (en mM): 138 K-gluconate, HEPES 10, 2 MgCl _2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl _2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. La solution interne a été ajusté à un pH de 7,3 à l'aide 1M KOH et une osmolarité de 270 à 275 mOsms.
5. Création d'un sceau sur le neurone gigaohm désiré. Rupture du sceau avec aspiration. Ceci constitue un enregistrement de cellules entières. Un amplificateur Multiclamp 700B a été utilisé dans notre configuration. L'amplificateur doit ensuite être placé dans le mode 'I = 0' pince de courant.

3. Application de la conductance dynamique avec pince

1. RTXI (www.rtxi.org) a été exécuté sur l'ordinateur de serrage dynamique. Un modèle personnalisé écrit contenant un récepteur NMDA a été chargé en mémoire. Le courant doit être injecté dans la cellule en temps réel est calculé par l'équation suivante:
   J'ai _NMDA = _g-NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * e ^(V-0.062 _m ^*))] * (V _m - E _NMDA) où g _NMDA est la conductance souhaitée (en N.-É.; Par défaut à 0 ns), [Mg] est la concentration de magnésium (fixé à 1,5 mM dans notre exemple ci-dessous), E _NMDA est le potentiel d'inversion pour le récepteur NMDA (fixé à 0 mV), et V _m est le potentiel de membrane de la cellule de mesure de l'amplificateur (en millivolts).
2. La sortie de l'ordinateur pince dynamique a été connecté à l'entrée de commande de l'amplificateur via un convertisseur analogique-numérique.
3. L'amplificateur a été placé dans le mode 'IC' pince de courant.
4. Entrez votre conductance souhaitée récepteur NMDA dans RTXI (par exemple 40ns). Vous devriez voir un éclat phasique des potentiels d'action. Alternativement, une conductance peut être donnée à RTXI via une sortie analogique (figure 1A, g (t) '). Un facteur d'échelle approprié doit être utilisé dans RTXI de convertir le signal de volts à Siemens.

4. Les résultats représentatifs

Une installation réussie pour l'application d'une conductance de l'aide du collier dynamique est montré dans la figure 1A. En utilisant cette configuration, nous avons fait une cellule entière d'enregistrement somatiques à partir d'un neurone dopaminergique dans la substance noire pars compacta. Cellules dopaminergiques généralement feu spontanément à des taux bas avec un motif stimulateur-comme. Un éclat de potentiels d'action peuvent être évoqués par l'application d'une conductance phasique du récepteur NMDA avec pince dynamique (figure 1B).

Figure 1: Application de la conductance des récepteurs NMDA en utilisant la technique du clamp dynamique. Installation du matériel illustrant A. les liens entre la plate-forme d'enregistrement intracellulaire et de l'ordinateur pince dynamique. B. Une salve de potentiels d'action est évoquée par l'application d'une conductance des récepteurs NMDA 40ns dans un enregistrement de cellules entières d'une substantia nigra pars compacta neurone dopaminergique.

Discussion

La technique du clamp dynamique démontré ici améliore la technique traditionnelle de l'injection de courant continu en permettant à l'expérimentateur de mimer les effets électriques de l'activation d'un récepteur. Dans cette vidéo, nous avons montré que l'on peut ajouter les effets de l'activation d'un récepteur NMDA à l'activité spontanée des neurones dopaminergiques, c'est à dire un éclat de potentiels d'action sont évoqués.

Grâce à la flexibilité de la mise en œuvre du matériel / logiciel, une variété d'extensions peuvent être utilisées. Le signe du courant injecté peut être commuté du négatif au positif, ce qui représente un scénario où les effets de récepteur activé est retiré d'un neurone. Neurones du modèle, représenté sous la forme d'une série d'équations différentielles, peuvent également être résolues numériquement et permettre à l'expérimentateur d'étudier les petits réseaux.

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview