L'applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

Riepilogo

In questo video ci dimostra come applicare una conduttanza in un neurone dopaminergico registrato nella configurazione cellule intere fette di cervello di ratto. Questa tecnica è chiamata la pinza dinamica.

Abstract

Neuroscienziati studiare la funzione del cervello, indagando come i neuroni nel cervello comunicano. Molti ricercatori guardare i cambiamenti nell'attività elettrica di uno o più neuroni in risposta ad un ingresso controllato sperimentalmente. L'attività elettrica dei neuroni possono essere registrati in fettine di cervello isolato utilizzando tecniche di patch clamp con micropipette di vetro. Tradizionalmente, gli sperimentatori possono mimare ingresso neuronale con iniezione diretta di corrente attraverso la stimolazione pipetta, elettrica delle cellule o altri collegamenti assonale nella sezione o manipolazione farmacologica di recettori situati sulla membrana della cellula neuronale registrata.

Iniezione diretta di corrente ha il vantaggio di passare una forma d'onda predeterminata corrente con elevata precisione temporale presso il sito della registrazione (di solito il soma). Tuttavia, non cambia la resistenza della membrana neuronale come canali ionici non sono fisicamente aperte. Iniezione di corrente impiega di solito impulsi rettangolari e quindi non modello la cinetica dei canali ionici. Infine, l'iniezione di corrente non può simulare i cambiamenti chimici nella cella che si verifica con l'apertura dei canali ionici.

Recettori possono essere fisicamente attivata dalla stimolazione elettrica o farmacologica. Lo sperimentatore ha una buona precisione temporale di attivazione del recettore con la stimolazione elettrica della fetta. Tuttavia, vi è limitata precisione spaziale di attivazione del recettore e la natura esatta di ciò che viene attivata su stimolazione è sconosciuta. Quest'ultimo problema può essere parzialmente alleviati da specifici agenti farmacologici. Purtroppo, il decorso temporale di attivazione di agenti farmacologici è di solito lenta e la precisione spaziale degli ingressi sul cellulare registrato è sconosciuta.

La tecnica del clamp dinamica consente uno sperimentatore di modificare l'attuale passato direttamente nella cella in base feedback in tempo reale del potenziale di membrana della cellula (Robinson e Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Per la revisione, si veda Prinz et al. 2004). Questo permette uno sperimentatore di imitare i cambiamenti elettrici che si verificano nel sito della registrazione in risposta all'attivazione di un recettore. Tempo reale i cambiamenti della corrente applicata sono determinati da una equazione matematica implementato in hardware.

Abbiamo recentemente utilizzato la tecnica dinamica morsetto per indagare la generazione di raffiche di potenziali d'azione per l'attivazione fasica dei recettori NMDA nei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. In questo video, dimostriamo le procedure necessarie per applicare una conduttanza recettore NMDA in un neurone dopaminergico.

Protocollo

1. Fetta di preparazione

1. Tagliare fettine di cervello utilizzando un microtomo vibrante. Abbiamo preparato 240 micron fette mesencefalo orizzontale da un isoflurano-anethetized ratto Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) utilizzando un microtomo vibrante (Microm HM 650V) in conformità con l'Università del Texas a cura San Antonio degli animali e del Comitato Istituzionale Usa.
2. Tenere le fette in una camera di incubazione fino al momento di registrare. Utilizziamo un contenitore di incubazione riscaldata a 32 ° C e riempito con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF; in mm): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 4 MgCl _{2, 2} CaCl _2, 10 destrosio, 25 NaHCO _3, 1,3 acido ascorbico, 2.4 piruvato di sodio e 0,05 glutatione.

2. Registrazione elettrofisiologiche

1. Trasferire la sezione per l'impianto di registrazione intracellulare in cui un fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) a 35 ° C viene perfuso. Usiamo il aCSF stesso punto 1.2 eccetto che 2mM MgCl ₂ è stato utilizzato e glutatione è stato omesso. Per fette orizzontalmente preparato, di solito dividono in due la fetta lungo la linea mediana.
2. Visualizza il neurone bersaglio. Noi visualizzati i singoli neuroni dopaminergici della substantia nigra con un sistema di imaging gradiente di contrasto.
3. Tirare un elettrodo con un estrattore elettronico elettrodo. Tiriamo elettrodi con una resistenza punta di 4-10 MΩ con una P97 Micropipetta estrattore (Instrument Company Sutter).
4. Riempire un elettrodo con la soluzione desiderata interno. Noi utilizziamo una soluzione contenente (in mm): 138 K-gluconato, 10 HEPES, 2 MgCl _2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl _2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. La soluzione interna è stata regolata a pH 7,3 con KOH 1M e osmolarità di 270-275 mOsms.
5. Fare un sigillo gigaohm sul neurone desiderato. Rottura del sigillo con aspirazione. Si tratta di una registrazione a cellula intera. Un amplificatore Multiclamp 700B è stato utilizzato nella nostra configurazione. L'amplificatore dovrebbe poi essere posto in modalità morsetto corrente 'I = 0'.

3. Applicazione della conduttanza con morsetto dinamica

1. RTXI (www.rtxi.org) è stato eseguito sul computer morsetto dinamico. Un modello personalizzato scritta contenente un recettore NMDA è stato caricato in memoria. La corrente da iniettare nella cella in tempo reale è calcolato dalla seguente equazione:
   I _NMDA =-g _NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3.57) * e ^(-V _m ^{* 0,062))]} * (V _m - E _NMDA) dove g è la conduttanza _NMDA desiderata (in nS; di default impostato a 0 nS), [Mg] è la concentrazione di magnesio (impostata a 1,5 mm nel nostro esempio qui sotto), E _NMDA è il potenziale di inversione per il recettore NMDA (impostato a 0 mV), e V _m è il potenziale di membrana della cellula misurata dall'amplificatore (in millivolt).
2. L'uscita dal computer pinza dinamico è stato collegato all'ingresso di comando dell'amplificatore tramite un convertitore analogico-digitale convertitore.
3. L'amplificatore è stato posto in modalità morsetto corrente del 'IC'.
4. Inserisci il tuo conduttanza desiderato recettore NMDA in RTXI (ad esempio 40ns). Si dovrebbe vedere una raffica fasica di potenziali d'azione. In alternativa, una conduttanza può essere somministrato a RTXI tramite un'uscita analogica (Figura 1A, 'g (t)'). Un fattore di scala appropriato deve essere utilizzato entro RTXI per convertire il segnale da volt a Siemens.

4. Rappresentante Risultati

Una configurazione di successo per l'applicazione di una conduttanza utilizzando il morsetto dinamica è mostrata in Figura 1A. Questa impostazione, abbiamo fatto un intero registrazione cellula somatica di un neurone dopaminergico nella substantia nigra pars compacta. Cellule dopaminergiche tipicamente fuoco spontaneamente a prezzi convenienti con un pacemaker-come il modello. Una raffica di potenziali d'azione può essere evocato mediante l'applicazione di una conduttanza fasica del recettore NMDA con morsetto dinamico (Figura 1B).

Figura 1: applicazione di una conduttanza recettore NMDA con la tecnica della dinamica morsetto. Configurazione hardware A. illustra le connessioni tra l'impianto di registrazione intracellulare e computer morsetto dinamico. B. Una raffica di potenziali d'azione è evocata dalla applicazione di una conduttanza 40ns recettore NMDA in una registrazione da una cellula intera substantia nigra pars compacta neurone dopaminergico.

Discussione

La tecnica di bloccaggio dinamico dimostrato qui migliora la tecnica tradizionale di iniezione diretta in corso, consentendo lo sperimentatore di imitare gli effetti elettrici della attivazione di un recettore. In questo video, abbiamo dimostrato che si possono aggiungere gli effetti di attivazione di un recettore NMDA per l'attività spontanea dei neuroni dopaminergici, cioè una raffica di potenziali d'azione sono evocati.

Grazie alla flessibilità di hardware / software di implementazione, una varietà di estensioni possono essere utilizzati. Il segno della corrente iniettata può essere commutato da negativo a positivo, che rappresenta uno scenario in cui viene rimosso gli effetti del recettore attivato da un neurone. Neuroni modello, rappresentato sotto forma di una serie di equazioni differenziali, può anche essere risolto numericamente e consentire lo sperimentatore di indagare le reti di piccole dimensioni.

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview