Die Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert in Rat Mittelhirn dopaminergen Neuronen Mit der Dynamic-Clamp-Technik

Zusammenfassung

In diesem Video zeigen wir, wie man einen Leitwert in einem dopaminergen Neuronen in der ganzen Zelle Konfiguration in Hirnschnitten der Ratte festgestellt werden. Diese Technik nennt man das dynamische Klemme.

Zusammenfassung

Neurowissenschaftler untersuchen die Funktion des Gehirns durch die Untersuchung, wie Nervenzellen im Gehirn kommunizieren. Viele Forscher betrachten Veränderungen in der elektrischen Aktivität eines oder mehrerer Neuronen in Reaktion auf eine experimentell-Eingang auf. Die elektrische Aktivität der Neuronen kann in isolierten Hirnschnitten mittels Patch-Clamp-Techniken mit Glasmikropipetten aufgezeichnet werden. Traditionell können Experimentatoren neuronalen Input durch direkte Injektion der aktuellen imitieren durch die Pipette, die elektrische Stimulation des anderen Zellen oder verbleibende axonalen Verbindungen in der Scheibe, oder pharmakologische Manipulation durch Rezeptoren auf der neuronalen Membran der aufgenommenen Zelle.

Gleichstrom Injektion hat den Vorteil, daß man eine vorgegebene Stromform mit hoher zeitlicher Präzision auf dem Gelände der Aufnahme (in der Regel die Soma). Allerdings ist es nicht ändern, der Widerstand der neuronalen Membran, da keine Ionenkanäle physisch geöffnet werden. Aktuelle Injektion in der Regel beschäftigt Rechteckimpulse und damit nicht-Modell die Kinetik der Ionenkanäle. Schließlich können Stromeinspeisung nicht imitieren die chemischen Veränderungen in der Zelle, die mit der Öffnung von Ionenkanälen auftritt.

Rezeptoren können physikalisch durch elektrische oder pharmakologische Stimulation aktiviert werden. Der Versuchsleiter hat eine gute zeitliche Präzision der Rezeptoraktivierung mit elektrischer Stimulation der Scheibe. Allerdings gibt es nur begrenzte räumliche Präzision der Rezeptor-Aktivierung und die genaue Natur dessen, was nach Stimulation aktiviert ist unbekannt. Das letztere Problem kann teilweise durch spezifische pharmakologische Wirkstoffe gelindert werden. Leider ist der zeitliche Verlauf der Aktivierung von pharmakologischen Wirkstoffen in der Regel langsam und die räumliche Genauigkeit der Eingänge auf die aufgenommenen Zelle ist unbekannt.

Die dynamische Clamp-Technik ermöglicht ein Experimentator auf die aktuelle Veränderung gingen direkt in die Zelle basierend auf Echtzeit-Feedback der Membran der Zelle (Robinson und Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Für eine Übersicht siehe Prinz et al. 2004). Dies ermöglicht ein Experimentator auf der elektrischen Veränderungen, die auf dem Gelände der Aufnahme treten als Reaktion auf die Aktivierung des Rezeptors zu imitieren. Real-time Veränderungen in der angewandten Strom werden durch eine mathematische Gleichung in Hardware implementiert bestimmt.

Wir haben vor kurzem die dynamische Clamp-Technik verwendet, um die Erzeugung von Bursts von Aktionspotentialen durch phasische Aktivierung von NMDA-Rezeptoren in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra pars compacta (Deister et al, 2009.; Lobb et al, 2010.) Zu untersuchen. In diesem Video zeigen wir die Verfahren benötigt, um eine NMDA-Rezeptor-Leitwert in einer dopaminergen Neuronen gelten.

Protokoll

1. Slice-Vorbereitung

1. Cut Hirnschnitten mit Hilfe eines vibrierenden Mikrotom. Wir bereiteten 240 um horizontale Mittelhirn Scheiben aus einer Isofluran-anethetized Sprague-Dawley Ratten (Charles River Laboratories) mit einem vibrierenden Mikrotom (Microm HM 650V) im Einklang mit der University of Texas at San Antonio Institutional Animal Care und Verwenden Committee.
2. Halten Sie die Scheiben in eine Inkubationskammer, bis Sie zur Aufnahme bereit sind. Wir verwenden eine Inkubationszeit Behälter erwärmt auf 32 ° C und mit künstlicher Liquor (aCSF; in mM): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 4 MgCl _{2, 2} CaCl _2, 10 Dextrose, 25 NaHCO _3, 1,3 Ascorbinsäure, 2,4 Natriumpyruvat und 0,05 Glutathion.

2. Elektrophysiologische Recording

1. Übertragen Sie die Scheibe, um die intrazelluläre Aufnahme rig, in denen eine künstliche Liquor (aCSF) bei 35 ° C wird durchblutet ist. Wir benutzen die gleichen aCSF wie in 1.2, außer dass 2 mM MgCl ₂ verwendet wurde und Glutathion wurde verzichtet. Für horizontal vorbereitet Scheiben, wir in der Regel halbieren die Scheibe entlang der Mittellinie.
2. Visualisieren Sie die Zielneuron. Wir visualisieren einzelnen Substantia nigra dopaminergen Neuronen mit einem Gradienten Gegensatz Imaging-System.
3. Ziehen Sie eine Elektrode mit einem elektronischen Elektrode Abzieher. Wir ziehen Elektroden mit einer Spitze Widerstand von 4-10 MOhm mit einer P97 Micropipette Puller (Sutter Instrument Company).
4. Füllen Sie eine Elektrode mit der gewünschten internen Lösung. Wir verwenden eine Lösung, die (in mM): 138 K-Gluconat, 10 HEPES, 2 MgCl _2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl _2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. Die interne Lösung wurde auf einen pH von 7,3 mit 1 M KOH und einer Osmolarität von 270-275 mOsms angepasst.
5. Machen Sie eine Gigaohm Dichtung auf die gewünschte Neuron. Rupture die Dichtung mit Absaugung. Dies stellt eine ganze Zelle Aufnahme. Ein Multiclamp 700B Verstärker wurde in unserer Konfiguration verwendet. Der Verstärker sollte dann in Stromzange die "I = 0"-Modus versetzt werden.

3. Leitwert Anwendung mit Dynamic Clamp

1. RTXI (www.rtxi.org) wurde auf dem dynamischen Clamp-Computer ausgeführt. Eine benutzerdefinierte geschrieben Modell mit einem NMDA-Rezeptor wurde in den Speicher geladen. Der Strom in der Zelle in Echtzeit injiziert wird durch die folgende Gleichung berechnet:
   Ich _NMDA =-g _NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * e ^(-V _m ^{* 0,062))]} * (V _m - E _NMDA), wo g _NMDA ist die gewünschte Leitfähigkeit (in nS; standardmäßig auf 0 gesetzt nS), [Mg] ist die Magnesium-Konzentration (auf 1,5 mm in unserem Beispiel unten), ist E _NMDA die Umkehrung Potenzial für den NMDA-Rezeptor (auf 0 mV) und V _m wird das Membranpotential der Zelle aus dem Verstärker gemessen (in Millivolt).
2. Der Ausgang aus der dynamischen Clamp-Computer wurde die Command-Eingang des Verstärkers über einen Analog-Digital-Wandler verbunden.
3. Der Verstärker wurde in Stromzange der "IC"-Modus versetzt.
4. Geben Sie die gewünschte NMDA-Rezeptor-Leitwert in RTXI (zB 40ns). Sie sollten eine phasische Burst von Aktionspotentialen. Alternativ kann eine Leitfähigkeit bis RTXI über einen analogen Ausgang (Abbildung 1A, 'g (t)') angegeben werden. Eine entsprechende Skalierungsfaktor muss innerhalb RTXI verwendet werden, um das Signal von Volt an Siemens zu konvertieren.

4. Repräsentative Ergebnisse

Ein erfolgreiches Setup für die Anwendung einer Leitfähigkeit unter Verwendung der dynamischen Klammer ist in Abbildung 1A dargestellt. Mit diesem Setup haben wir eine ganze Zelle somatischen Aufnahme von einem dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra pars compacta. Dopaminergen Zellen in der Regel spontan Feuer zu günstigen Preisen mit einem Herzschrittmacher-ähnliches Muster. Ein Burst von Aktionspotentialen kann durch phasische Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert mit dynamischen Klemme (Abbildung 1B) hervorgerufen werden.

Abbildung 1: Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert mit dem dynamischen Clamp-Technik. A. Hardware-Setup, welches die Verbindungen zwischen den intrazellulären Aufnahme rig und dynamische Clamp-Computer. B. Ein Burst von Aktionspotentialen wird durch Anwendung eines 40ns NMDA-Rezeptor-Leitwert in einer ganzen Zelle Aufnahme von einem Substantia nigra pars compacta dopaminergen Neuronen hervorgerufen werden.

Diskussion

Die dynamische Clamp-Technik demonstriert hier eine Verbesserung gegenüber der traditionellen Technik der direkten Stromeinspeisung, indem der Experimentator die elektrischen Effekte der Aktivierung eines Rezeptors zu imitieren. In diesem Video haben wir gezeigt, dass man die Effekte hinzufügen Aktivierung von NMDA-Rezeptor, die spontane Aktivität der dopaminergen Neuronen, dh ein Platzen der Aktionspotentiale hervorgerufen werden.

Durch die Flexibilität der Hardware / Software-Implementierung kann eine Vielzahl von Erweiterungen verwendet werden. Das Zeichen des injizierten Strom von negativ auf positiv geschaltet werden, was einem Szenario, in dem die Auswirkungen der aktivierten Rezeptor von einem Neuron entfernt wird. Modell Neuronen, in Form einer Reihe von Differentialgleichungen dargestellt werden, können auch numerisch gelöst werden und erlauben es dem Forscher, kleine Netzwerke zu untersuchen.

Materialien

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview