Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Özet

Bu video, sıçan beyin dilim tam hücre yapılandırması kaydedilen bir dopaminerjik nöron içine iletkenliği nasıl uygulanacağını göstermektedir. Bu teknik, dinamik kelepçe denir.

Özet

Nörobilimadamları beyin iletişim nöronların nasıl araştıran beyin fonksiyonu çalışma. Birçok araştırmacı, deneysel-kontrollü giriş yanıt olarak bir veya daha fazla nöronların elektriksel aktivite değişiklikleri bekliyoruz. Nöronların elektriksel aktivite cam mikropipetler yama klemp teknikleri kullanılarak izole beyin dilimleri kaydedilebilir. Geleneksel olarak, deneyciler kaydedilen hücre nöronal membran üzerinde bulunan alıcılar tarafından dilim, ya da farmakolojik manipülasyon diğer hücreleri veya aksonal bağlantıları kalan pipet, elektrik stimülasyonu ile akım direkt enjeksiyon nöronal giriş taklit edebilir.

Doğru akım enjeksiyon kayıt yerinde (genellikle soma) yüksek temporal hassas önceden belirlenmiş bir akım dalga geçme avantajı vardır. Ancak, fiziksel olarak hiçbir iyon kanalları açılır gibi nöronal membran direnci değişmez. Şu enjeksiyon genellikle dikdörtgen darbeler istihdam ve böylece iyon kanallarının kinetik modeli değildir. Son olarak, mevcut enjeksiyon iyon kanallarının açılması ile oluşan hücre içindeki kimyasal değişimler taklit edilemez.

Reseptörler fiziksel, elektriksel veya farmakolojik stimülasyon ile aktif hale getirilebilir. Deneyci dilim elektrik stimülasyonu ile reseptör aktivasyonu iyi temporal hassasiyete sahiptir. Reseptör aktivasyonu ve stimülasyon üzerine aktive ne olduğunu tam bir doğa Ancak, sınırlı uzaysal hassas bilinmemektedir. Bu ikinci sorun, belirli farmakolojik ajanları tarafından kısmen kontrol altına alınabilir. Ne yazık ki, farmakolojik ajanların aktivasyon zaman ders tipik olarak yavaş ve kaydedilen hücre üzerine girişleri mekansal hassasiyet bilinmemektedir.

Inceleme için, bkz. Prinz et; dinamik klemp tekniği bir deneyci hücre membran potansiyeli (Robinson ve Kawai 1993, Sharp ve ark, 1993a, b gerçek zamanlı geri bildirim dayalı doğrudan hücre içine geçen akımı değiştirmek için izin verir. diğerleri, 2004). Bu bir deneyci bir reseptör aktivasyonuna yanıt olarak kayıt yerinde meydana gelen elektriksel değişimleri taklit etmek için izin verir. Gerçek zamanlı değişiklikleri uygulanan mevcut donanım uygulanan matematiksel bir denklem tarafından belirlenir.

Biz son zamanlarda, substantia nigra pars compacta (; Lobb ve ark, 2010. Deister ve ark, 2009) dopaminerjik nöronlarda NMDA reseptörlerinin fazik aktivasyonu nesil aksiyon potansiyelleri patlamaları araştırmak için dinamik klemp tekniği kullanmıştır . Bu video, dopaminerjik nöron bir NMDA reseptör iletkenlik uygulamak için gerekli prosedürleri göstermektedir.

Protokol

1. Dilim Hazırlık

1. Titreşen bir mikrotom kullanarak beyin dilim kesin. University of Texas at San Antonio Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu uygun bir titreşimli mikrotom (Microm HM 650V) kullanarak bir izofluran anethetized Sprague-Dawley sıçan (Charles River Laboratuvarları) 240 mm yatay orta beyin dilimleri hazırladı.
2. Kaydetmek için hazır olana kadar bir kuluçka odasında dilim tutun. (ACSF; mM) 32 ° C'ye kadar ısıtılır ve yapay beyin omurilik sıvısı ile dolu bir inkübasyon kabı kullanın: 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH ₂ PO _{4, 4} MgCl _{2, 2, CaCl 2,} 10 dekstroz, 25 _NaHCO 3 , 1.3 askorbik asit, 2.4 sodyum piruvat ve 0.05 glutatyon.

2. Elektrofizyolojik Kayıt

1. 35 bir yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ° C perfüze olduğu hücre içi kayıt donatmak için dilim aktarın. Biz bu 2mm MgCl ₂ ve glutatyon atlandı hariç, 1.2 'de aynı aCSF kullanabilirsiniz . Yatay hazırlanan dilim için, genellikle orta hat boyunca dilim iki eşit parçaya böler.
2. Hedef nöron gözünüzde canlandırın. Biz bir degrade kontrast görüntüleme sistemi ile bireysel substantia nigra dopaminerjik nöronların görüntülendi.
3. Elektronik bir elektrot çektirmenin kullanarak bir elektrot çekin. Biz 4-10 M P97 Mikropipet çektirmesi (Sutter Instrument Company) kullanarak bir ucu direnci ile elektrotlar çekin.
4. İstenen iç çözümü ile bir elektrot doldurun. 138 K-glukonat, 10 Hepes, 2 MgCl _2, 0.2 EGTA, 0.0001 CaCl _2, 4, Na-ATP, 0.4 Na-GTP: Biz içeren bir çözüm (mM) kullanın. Iç çözüm 1M KOH ve 270-275 mOsms bir ozmolarite 7.3 pH ayarlandı.
5. Istenilen nöron üzerine gigaohm mühür olun. Rüptürü ile mühür emme. Bu, bir bütün hücre kayıt teşkil eder. Multiclamp 700B amplifikatör yapılandırma kullanılmıştır. Amplifikatör sonra 'I = 0' kelepçe modunda konulmalıdır.

3. Dinamik Kelepçe İletkenlik Uygulama

1. RTXI (www.rtxi.org) dinamik kelepçe bilgisayarda idam edildi. NMDA reseptör içeren özel bir yazılı modeli belleğe yüklenir. Gerçek zamanlı olarak hücre içine enjekte edilecek akım aşağıdaki denklemle hesaplanır:
   Ben _NMDA =-g _NMDA * [1 / (1 ​​+ (Mg / 3,57) * e ^(-V _m ^{* 0.062))]} * (V _m - E _NMDA) g _NMDA istenilen iletkenlik (NS; varsayılan) 0 nS, [Mg] E _NMDA, NMDA reseptör (0 mV) ters potansiyel magnezyum konsantrasyonu (aşağıdaki örnekte 1.5 mM), ve _V m membran potansiyeli amplifikatör (milivolt) ölçülen hücre.
2. Dinamik kelepçe bilgisayardan çıkış, analog-dijital dönüştürücü ile amplifikatör Komutanlığı girişine bağlanmış oldu.
3. Amplifikatör, 'BM' kelepçe modunda yerleştirildi.
4. İstediğiniz NMDA reseptör iletkenlik RTXI (örneğin 40nS) içine girin. Aksiyon potansiyelleri fazik patlaması göreceksiniz. Alternatif olarak, analog bir çıkış (Şekil 1A, 'g (t)') ile bir iletkenlik RTXI için verilebilir. Volt Siemens sinyal dönüştürmek için uygun bir ölçekleme faktörü RTXI içinde kullanılması gerekir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1A, iletkenlik, dinamik kelepçe kullanarak bir uygulama için başarılı bir kurulum gösterilmiştir. Bu kurulum kullanarak, substantia nigra pars compacta dopaminerjik nöron bir bütün hücre somatik kayıt yaptı. Dopaminerjik hücreler tipik olarak bir kalp pili gibi deseni ile düşük fiyatla kendiliğinden ateş. Aksiyon potansiyelleri bir patlama dinamik kelepçe (Şekil 1B) ile NMDA reseptör iletkenlik fazik uygulama tarafından uyarılmış olabilir.

Şekil 1: Uygulama, dinamik klemp tekniği kullanarak bir NMDA reseptör iletkenlik . A. Donanım ayarları, hücre içi kayıt teçhizat ve dinamik kelepçe bilgisayar arasındaki bağlantıları gösteren. Aksiyon potansiyelleri B. patlama substantia nigra pars compacta dopaminerjik nöron bir bütün hücre kayıt 40nS NMDA reseptör iletkenlik uygulama tarafından uyarılmış.

Tartışmalar

Burada gösterilen dinamik klemp tekniği deneyci bir reseptör aktivasyonu elektrik etkilerini taklit etmek için izin vererek, geleneksel akım enjeksiyon tekniği üzerine geliştirir. Bu video, dopaminerjik nöron spontan aktivite için bir NMDA reseptör aktivasyonu, uyarılmış yani aksiyon potansiyelleri bir patlama efektleri ekleyebilirsiniz göstermiştir.

Donanım / yazılım uygulama esnekliği nedeniyle, çeşitli uzantıları kullanılabilir. Enjekte edilen akım işareti, bir nöron aktif reseptör etkileri kaldırılır bir senaryo temsil, pozitif negatif geçirilebilir. Diferansiyel denklemler şeklinde bir dizi temsil Model nöronlar, aynı zamanda sayısal olarak çözüldü ve deneyci küçük ağlar araştırmak için izin olabilir.

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview