동적 클램프 기법을 사용 랫 Midbrain Dopaminergic 뉴런에서 NMDA 수용체의 전도의 응용

요약

이 비디오에서는, 우리는 쥐의 뇌 조각의 전체 세포 구성에 기록된 dopaminergic 신경 세포로 전도성을 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 기법은 동적 클램프라고합니다.

초록

Neuroscientists는 두뇌의 뉴런 통신하는 방법을 조사하여 뇌의 기능을 연구합니다. 많은 조사는 실험적으로 제어 입력에 대한 응답으로 하나 이상의 뉴런의 전기 활동의 변화보세요. 뉴런의 전기 활동은 유리 micropipettes와 패치 클램프 기법을 사용하여 절연 뇌 슬라이스에 기록하실 수 있습니다. 전통적으로, 경험이 기록된 세포의의 연결을 막에있는 수용체에 의해 슬라이스, 또는 약리 조작에있는 다른 셀 또는 남은 axonal 연결 피펫, 전기 자극을 통해 현재의 직접 분사로의 연결을 입력을 모방 수 있습니다.

직류 주사 녹음이 (보통 소마)의 사이트에서 높은 시간적 정밀도로 만들어진 전류 파형을 전달하는 장점이 있습니다. 그러나, 이것은 이온 채널이 개설되지 않습니다 물리적으로의 연결을 막의 저항을 변경하지 않습니다. 현재 분사는 일반적으로 직사각형 펄스를 고용하기 때문에 이온 채널의 반응 속도론을 모델하지 않습니다. 마지막으로, 현재 분사는 이온 채널의 개통과 함께 발생하는 세포에서 화학적 변화를 모방 수 없습니다.

수용체는 물리적 또는 전기적 자극에 의​​해 약리 활성화할 수 있습니다. 실험자들은 조각의 전기 자극과 수용체 활성화 잘 시간적 정밀도를했다. 수용체 활성화 자극시 활성화되어 어떤의 정확한 성격 그러나,이 제한됩니다 공간적 정밀도 알 수 있습니다. 이 후자의 문제는 부분적으로 특정 약리 에이전트가 완화된 수 있습니다. 불행히도, 약리 대리인의 활성화 시간 과정은 일반적으로 속도가 느린되고 기록된 세포에 입력의 공간적 정밀도 알 수 있습니다.

. 검토를 위해, 프린츠 동부 표준시를 참조하고, 동적 클램프 기술은 실험자의 세포의 막 전위 (로빈슨과 카와이 1993, 샤프 외, 1993a, b의 실시간 피드백을 기반으로 세포에 직접 전달되는 전류를 변경할 수 있습니다 알. 2004). 이것은 실험자이 수용체의 활성화에 대한 응답으로 녹화 현장에서 발생하는 전기적 변화를 모방 수 있습니다. 적용 전류에 실시간으로 변경되며, 변경된 사항은 하드웨어에서 구현 수학적 방정식에 의해 결정됩니다.

우리는 최근 substantia 니그라 갈 거예요 compacta (.; 로브 외, 2010. Deister 외, 2009)의 dopaminergic 뉴런에서 NMDA 수용체의 phasic 활성화하여 실천 가능성의 파열의 생성을 조사하기 위해 동적 클램프 기법을 사용했습니다. 이 비디오에서는, 우리는 dopaminergic 신경 세포에 NMDA 수용체의 전도성을 적용하는 데 필요한 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 슬라이스 준비

1. 진동 마이크로톰를 사용하여 뇌의 슬라이스 컷. 우리는 산 안토니오 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 텍사스 대학에 따라 진동 마이크로톰 (Microm HM 650V)를 사용하여 isoflurane - anethetized 스프 라그 - 돌리 쥐 (찰스 리버 연구소)에서 240 μm의에게 수평 midbrain의 조각을 준비했습니다.
2. 당신이 기록 준비가 될 때까지 배양 챔버의 조각 유지. (aCSF, MM)을 우리는 32 ° C로 가열하고 인공 뇌척수 가득 부화 컨테이너를 사용하여 : 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 아니 ₂ PO _4, 4 MgCl _{2, 2} CaCl _2, 10 덱스 트로 오스, 25 NaHCO _3, 1.3 아스코르비 산, 2.4 나트륨 pyruvate와 0.05 글루타티온.

2. Electrophysiological 녹음

1. 35 인공 뇌척수 (aCSF)가 ° C가 perfused되고있는 세포 녹음 장비에 대한 슬라이스를 전송합니다. 우리는 2mM MgCl _2가 사용되었고 글루타티온가 생략되었습니다 제외 1.2와 같은 aCSF을 사용합니다. 수평으로 준비 조각을 위해, 우리는 일반적으로 정중선을 따라 조각을 이등분.
2. 대상 신경 세포를 시각화. 우리는 기울기 콘트라스트 이미징 시스템과 개별 substantia 니그라 dopaminergic의 뉴런을 시각.
3. 전자 전극 풀러를 사용하여 전극을 당기세요. 우리는 MΩ P97 Micropipette 풀러 (서터 악기 회사)를 사용 40-10의 팁 저항과 전극을 가져옵니다.
4. 원하는 내부 솔루션 전극을 입력합니다. 138 K - 글루 콘 산, 10 HEPES, 2 MgCl _2, 0.2 EGTA, 0.0001 CaCl _2, 4 나 - ATP, 0.4 나 - GTP : 우리는이 포함된 솔루션을 (MM)을 사용합니다. 내부 솔루션은 1M 코와 270-275 mOsms의 osmolarity를​​ 사용하여 7.3의 산도 조정되었습니다.
5. 원하는 신경 세포에 gigaohm 인감을 확인합니다. 파열 흡입과 인감. 이것은 전체 휴대폰 녹음을 구성합니다. Multiclamp 700B 앰프는 우리의 구성에 사용되었습니다. 증폭기는 다음의 '= 0'현재 클램프 모드에 배치되어야합니다.

3. 다이나믹 클램프와 전도성 신청

1. RTXI (www.rtxi.org)은 동적 클램프 컴퓨터에서 실행되었습니다. NMDA 수용체를 포함하는 사용자 정의로 작성된 모델은 메모리에로드되었습니다. 실시간으로 세포에 주입되는 전류는 다음 공식에 의해 계산됩니다 :
   I _NMDA = - g _NMDA * [1 / (1 ​​+ ([MG] / 3.57) * E ^{(- V} _m ^{* 0.062))]} * (V _m - E _NMDA) 여기서 g _{NMDA 원하는} 전도성 (NS입니다; 기본적으로) 0 NS로 설정 [MG]는, E _NMDA는 NMDA 수용체 (0 MV으로 설정)에 대한 반전 가능성 마그네슘 농도 (아래의 예제에서 1.5 mm까지 세트)입니다, 그리고 V _M은 막 잠재력이다 (millivolts)를 앰프에서 측정된 세포의.
2. 동적 클램프 컴퓨터에서 출력은 아날로그 - 디지털 변환기를 통해 앰프의 명령 입력에 연결되었습니다.
3. 앰프는 'IC'현재 클램프 모드에 배치되었다.
4. RTXI (예 : 40nS)에 원하는 NMDA 수용체의 전도성을 입력합니다. 당신은 행동 잠재력의 phasic 버스트가 나타납니다. 또한, 전도성은 아날로그 출력 (그림 1A, 'g (t)')를 통해 RTXI에 주어진 수 있습니다. 적절한 스케일링 계수는 볼트에서 지멘스 신호를 변환하는 RTXI 이내에 사용해야합니다.

4. 대표 결과

동적 클램프를 사용하여 전도성의 응용 프로그램에 대한 성공적인 설정은 그림 1A에 표시됩니다. 이 설정을 사용하여, 우리는 substantia 니그라 갈 거예요 compacta의 dopaminergic 신경 세포에서 전체 세포 체세포의 녹음을했다. Dopaminergic 세포는 일반적으로 맥박 조정기와 같은 패턴으로 낮은 속도에서 저절로 불이났다. 액션 잠재력의 파열은 동적 클램프 (그림 1B)와 NMDA 수용체의 전도성의 phasic 응용 프로그램에 의해 evoked 수 있습니다.

그림 1 : 동적 클램프 기법을 사용하여 NMDA 수용체의 전도성의 응용. A. 하드웨어 설치 세포내 녹음 장비 및 동적 클램프 컴퓨터 사이의 연결을 보여주는. 액션 잠재력의 B. 파열은 substantia 니그라 갈 거예요 compacta dopaminergic 신경 세포에서 전체 셀 녹음 40nS에서 NMDA 수용체의 전도성의 응용 프로그램에 의해 evoked입니다.

토론

여기 시연 동적 클램프 기술은 실험자이 수용체의 활성화의 전기 효과를 모방 수 있도록함으로써 직류 분사의 전통적인 기법에이 향상됩니다. 이 비디오에서는, 우리는 dopaminergic 신경 세포의 자발적인 활동에 NMDA 수용체의 활성화의 evoked 아르 행동 잠재력의 버스트 즉 하나는 효과를 추가할 수 것으로 나타났습니다.

하드웨어 / 소프트웨어 구현의 유연성으로 인해, 확장의 다양한 사용하실 수 있습니다. 주입 전류의 서명이 활성화 수용체의 영향이 신경 세포에서 제거됩니다 시나리오를 대표하는, 긍정을 부정에서 전환하실 수 있습니다. 양식 미분 방정식의 일련의 대표 모델 뉴런은 또한 숫자 해결하고 실험자들이 소규모 네트워크를 조사하도록 할 수 있습니다.

자료

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview