ダイナミッククランプ法を用いたラット中脳ドーパミン作動性ニューロンにおけるNMDA受容体のコンダクタンスのアプリケーション

要約

このビデオでは、我々はラット脳スライスにおける全細胞の構成で記録されたドーパミン作動性ニューロンへのコンダクタンスを適用する方法を示します。この手法は、ダイナミッククランプと呼ばれています。

要約

神経科学者は脳通信におけるニューロン方法を調べることにより、脳の機能を研究する。多くの研究者らは、実験的に制御入力への応答の1つまたは複数のニューロンの電気的活動の変化を見てください。ニューロンの電気活動は、ガラスマイクロピペットを使用してパッチクランプ技術を使用して分離された脳切片で記録することができます。伝統的に、実験者は、ピペットを流れる電流の直接注入によって記録された細胞の神経細胞膜上にある受容体によって他の細胞やスライス内の残りの軸索の接続、または薬理学的操作の電気的刺激を神経入力を模倣することができます。

直接注入​​電流は録音（通常相馬）のサイトに高い時間精度で所定の電流波形を渡すの利点があります。しかし、それはイオンチャネルが物理的に開かれていないとして、神経細胞膜の抵抗値を変更しません。電流注入は、通常の矩形パルスを採用していますので、イオンチャネルの動態をモデル化していません。最後に、電流注入は、イオンチャネルの開口部に発生する細胞内の化学変化を模倣することはできません。

受容体は、物理的、電気的または薬理学的刺激によって活性化することができます。実験者は、スライスの電気刺激による受容体の活性化の良い時間精度を持っています。しかし、受容体の活性化の限られた空間的な精度があると刺激により活性化されるものの正確な性質は不明です。この後者の問題は、部分的に特定の薬理学的薬剤によって緩和することができます。残念なことに、薬理学的薬剤の活性化の時間経過は一般的に遅いですし、記録されたセルへの入力の空間的な精度は不明です。

。レビューのために、プリンツらを参照して 、ダイナミッククランプ法は、実験者は、細胞の膜電位（ロビンソンと河合1993、シャープら 、1993a、bのリアルタイムのフィードバックに基づいて、セルに直接渡される電流を変更することができますら、2004）。これは、実験者は、受容体の活性化に応答して、記録のサイトで発生する電気的変化を模倣することができます。印加電流のリアルタイムの変化は、ハードウェアで実装されて数学的な方程式によって決定されます。

我々は最近、黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンにおけるNMDA受容体の相動活性化によって活動電位のバーストの発生を調査するために、ダイナミッククランプ法を用いている（ダイスターら、2009;。。ロブら 、2010）。このビデオでは、我々は、ドーパミン作動性ニューロンへのNMDA受容体のコンダクタンスを適用するために必要な手順を示しています。

プロトコル

1。スライスの準備

1. 振動ミクロトームを用いて脳切片をカット。私たちは、サンアントニオ動物実験用の委員会でテキサス大学に従って振動ミクロトーム（Microm HM 650V）を使用して、イソフルランanethetizedのSprague - Dawleyラット（チャールズリバー研究所）から240ミクロ​​ンの水平方向の中脳のスライスを用意。
2. 録音の準備が整うまで、インキュベーションチャンバー内のスライスをしてください。 （ACSF; mMで）我々は、32℃に加熱し、人工脳脊髄液で満たされた培養容器を使用する：126のNaCl、2.5 KClを、1.25のNaH ₂ PO _4、4のMgCl _2、2のCaCl _2、10デキストロース、25 NaHCO _3を 、 1.3アスコルビン酸、2.4ピルビン酸ナトリウム、0.05グルタチオン。

2。電気生理学的記録

1. 35℃の人工脳脊髄液（ACSF）細胞内記録のリグにスライスを移し° Cを灌流されています。我々は、2mmのMgCl _2が使用され、グルタチオンが省略されたことを除いて1.2と同じACSFを使用してください。水平に準備スライスの場合、我々は通常、正中線に沿ってスライスを二等分する。
2. ターゲットニューロンを可視化する。我々は、グラデーションのコントラストイメージングシステムと個々の黒質ドーパミン作動性ニューロンを可視化。
3. 電子電極プラーを使用して電極を引き出します。我々は、P97マイクロピペットプラー（サター器械公司）を使用してMΩ4-10の先端抵抗と電極を引き出します。
4. 目的の内部溶液を電極を埋める。 138 K -グルコン酸、10 HEPES、2のMgCl _2、0.2 EGTA、0.0001のCaCl _2、4のNa - ATP、0.4のNa - GTP：私たちは、含有する溶液を（mMで）使用してください。内部溶液を、1M KOHと270から275 mOsmsの浸透圧を用いて7.3のpHに調整した。
5. 希望のニューロンにgigaohmシールを行う。破裂吸引とシール。これは全細胞記録を構成している。 Multiclamp 700Bアンプは、私達の構成で使用されていました。アンプはその後、"I = 0'カレントクランプモードで配置する必要があります。

3。ダイナミッククランプ付きコンダクタンスのアプリケーション

1. RTXI（www.rtxi.org）は、ダイナミッククランプのコンピュータ上で実行されました。 NMDA受容体を含むカスタム書かれたモデルは、メモリにロードされました。リアルタイムで細胞に注入する電流は次式で計算されます。
   私_NMDA = - gを_NMDA * [1 /（1 +（[MG] / 3.57）* ^{E（- V} _M ^{* 0.062））]} *（V _M - E _{NMDA）G NMDAが}目的_のコンダクタンス（NSのです。デフォルトでは）0 nsに設定し、[MG]は、E _NMDAは NMDA受容体（0 mVに設定）のための逆転の可能性マグネシウム濃度（以下の例は1.5 mmに設定）です、そして、V _mは膜電位です。アンプから測定セル（ミリボルト単位）。
2. ダイナミッククランプコンピュータからの出力は、アナログ - デジタル変換器を介して増幅器のコマンド入力に接続されていた。
3. アンプは、"IC"カレントクランプモードに置かれた。
4. RTXI（例えば40nsの）に、ご希望のNMDA受容体のコンダクタンスを入力してください。あなたは、活動電位の一過性バーストが表示されるはずです。また、コンダクタンスは、アナログ出力（図1A、"G（T）"）を経由してRTXIに与えることができます。適切なスケーリング係数は、ボルトからシーメンスに信号を変換するためにRTXI内で使用されている必要があります。

4。代表的な結果

ダイナミッククランプを用いてコンダクタンスのアプリケーションの正常にセットアップを図1Aに示されています。このセットアップを使用して、我々は、黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンからホールセル体の記録を作った。ドーパミン作動性細胞は、通常、ペースメーカーのようなパターンで、低レートで自発的に発生させます。活動電位のバーストは、ダイナミッククランプ（図1B）とNMDA受容体のコンダクタンスの位相性アプリケーションによって誘発することができます。

図1：ダイナミッククランプ法を用いたNMDA受容体のコンダクタンスの応用。細胞内記録のリグとダイナミッククランプのコンピュータ間の接続を示すA.ハードウェアのセットアップ。 B.活動電位のバーストは、黒質緻密部ドーパミン作動性ニューロンからホールセル記録で40nsのNMDA受容体のコンダクタンスのアプリケーションによって誘発される。

ディスカッション

ここに示したダイナミッククランプ法は、実験者は、受容体の活性化の電気的効果を模倣できるようにすることで、直流注入の伝統的な技法を改良したものです。このビデオでは、我々は、ドーパミン作動性ニューロンの自発活動に対するNMDA受容体の活性化が、誘発される活動電位のバースト、すなわち一つのエフェクトを追加できることが示されている。

ハードウェア/ソフトウェアの実装の柔軟性により、各種拡張機能を使用することができます。注入電流の符号は、活性化受容体の効果はニューロンから削除されるシナリオを表す、マイナスからプラスに切り替えることができます。フォーム微分方程式のシリーズで表されるモデルのニューロンは、、また数値的に解くと、実験者は小規模なネットワークを調査することができます。

資料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview